水牛精原干细胞体外培养体系初步建立.pdfVIP

中围畜牧兽医学会动物繁晡学分会第十六届学术研讨会论文集 竺鼍!!!!皇皇苎皇皇詈I 水牛精原干细胞体外培养体系的初步建立 杨欢1，罗奋华2，赵会敏1，李敏霞1，张飒1，左二伟1，胡林林1，杨小淦1，吴应积扣，卢 克焕卜 (1．广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁530005；2．内蒙 古大学哺乳动物繁殖生物学与生物技术教育部重点实验室，呼和浩特010021) 引言 Stem Cells，简称SSCs)对雄性动物的生殖作用至关重要。 精原干细胞(Sperrnatogonial SSCs是定位于雄性哺乳动物睾丸曲细精管基底膜上的一类生殖干细胞，是体内唯一可将遗传 物质传递到’F～代的成体干细胞。在哺乳动物睾丸中，SSCs既能分化产生成熟的精子，又能 进行自我更新维持其数量。精原干细胞对于研究精子的发生和调控机制、雄性辅助生殖、种 公眚的保种和育种都具有重要意义。但我们对SSCs知之甚少，除啮齿动物外，大动物SSCs 的体外长期培养与鉴定方法尚未建立。本研究以水牛为研究对象，目的在于探索水牛SSCs 体外培养与鉴定的方法，为进一步建立水牛SSCs体外培养系统，深入研究水牛精子发生过 程的重编程机理及建立水牛新品种育种平台奠定基础。 材料与方法 实验材料来源于104日龄的本地．尼里杂交一代水牛。无菌取出睾丸，分离曲细精管并剪 碎，酶消化成糊状并利用差异贴壁法取得SSCs。随后将分离的SSCs接种在丝裂霉素处理过 的STO细胞上进行培养，并在培养液中加入生长因子，每隔几代抽取样品进行RT-PCR分析 CDH1)的抗体对体外培养的SSCs与睾丸冰冻切片上的SSCs进行免疫荧光染色。 结果 本研究以29水牛曲细精管为起始材料，成功获得1．5×104个SSCs。现阶段我们已将SSCs 体外培养超过4个月，传至32代。细胞计数的结果显示体外培养的SSCs的增殖性能不变。 同。免疫荧光染色结果显示体外培养的SSCs与睾丸冰冻切片上的SSCs都呈PGP9．5、C．KIT、 CDHl阳性。以上研究结果说明我们目前已初步建立起了水牛SSCs体外培养系统。 讨论 水牛精原干细胞的成功分离说明差异贴壁法可将SSCs与其它睾丸体细胞分开。本研究 分离所得的SSCs数量较少，主要原因可能是SSCs在睾丸细胞中所占比例较低，其次在操作 过程中不可避免地损失了一部分干细胞。RT-PCR结果表明本实验培养的SSCs在转录水平表 达了SSCs靶标分子，同时对睾丸冰冻切片与培养的SSCs进行免疫荧光染色的结果表明体外 培养的SSCs很好地维持了体内SSCs的细胞特性。本实验的结果为日后研究精原干细胞及对 其进行遗传修饰等操作提供了条件。 150