重组猪输血传播病毒2型Cap蛋白在昆虫杆状病毒中表达及鉴定.pdfVIP

396《》2011年学术年会 T030038 重组猪输血传播病毒2型Cap蛋白在昆虫杆状病毒中的表达及鉴定 刘建波黄立平危艳武吴洪丽 刘长明 (中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨 150001) 目的猪源的输血传播病毒(唧)是一种无囊膜的单股负链环状DNA病毒，其基因组为2．8kb，有2 个基因型：唧1和唧，2。病毒基因组含3个大的阅读框，其中ORFl编码壳体蛋白，具有良好的 免疫原性，是建立诊断方法的理想靶抗原。用PCR法对猪群的唧2流行病学调查发现，P1]Ⅳ2在 我国猪群中阳性率较高。由于病毒分离存在困难，尚未建立血清学诊断方法。本研究采用昆虫杆状病毒 表达系统表达P1T、，2．ORFl基因编码的Cap蛋白，为该病毒诊断方法奠定基础。 材料和方法 加入细胞转染试剂转染昆虫细胞(Sf21)，取转染细胞培养上清液进行重组杆状病毒蚀斑克隆，选取带有Lac 细胞单纯进行蛋白表达，按不同时间点收集细胞培养物，用SDS—PAGE鉴定表达，用抗V5标签的抗体进 行Westem．blot试验鉴定重组蛋白的免疫活性。采用Ni2+亲和层析法对重组蛋白进行了纯化。 结果 扩增的PTlw2一ORFl基因与预期相符，全长序列为1884 bp，将构建的杆状病毒重组转移质粒命名 病毒感染后48h出现蛋白表达，96h达到高峰；重组蛋白在79．2kDa处有一条特异性条带出现，与预 测分子量大小一致。Westernblot鉴定结果表明，重组蛋白与V5标签形成一条明显的特异条带，表明具 有较好的免疫活性。由于在重组蛋白C末端设计了6×His．Tag标签，用Ni2+亲和层析法获得的纯化蛋 白的纯度达90．5％。 讨论 由于昆虫杆状病毒表达系统能够对蛋白质正确组装，并且蛋白质合成时不受稀有密码子影响，表达 的蛋白免疫活性好，广泛用于诊断抗原的研制。由于唧2一ORFl基因编码的蛋白是PTTV2结构蛋白 的重要成分，其表面具有许多不同的抗原表位，在致病性和诱导机体产生保护性免疫应答起重要作用。 本研究获得的重组蛋白在C末端设计了V5标签和His—Tag序列，为蛋白的鉴定及纯化创造了条件。因 此，利用纯化的重组蛋白作为包被抗原建立ELISA诊断方法用于检测现地血清抗体，为该病毒流行病 学研究提供了技术支撑。