体细胞核移植生产转TLR4基因绵羊.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第}‘六届学术研讨会论文集 体细胞核移植生产转TLR4基因绵羊 邓守龙1，姚玉昌2，崔茂盛3，刘国世1，连正兴p (1．中国农业大学动物科技学院，北京100193；2．东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 12) 3．天津市畜牧兽医研究所，天津3001 150030； 引言 Toll样受体是机体抵抗病原体感染的第一道防线，其中TLR4主要识别革兰氏阴性苗细 胞壁中的脂多糖和脂壁酸。机体受到病原感染时，启动TLR4信号通路，激活NT．r,B途径释 放多种炎症细胞因子，这些细胞因子促进中性粒细胞向炎症部位聚集以清除细菌、病原体。 革兰氏阴性菌种类很多，如大肠杆菌、布氏杆菌等，其对畜牧业生产造成的危害极大，尤其 是对绵羊养殖业的影响。转基因克隆技术已广泛应用在提高生长速度、生产性能和抗病育种 等方面，但核移植技术效率低。本研究构建TLR4基因表达载体，优化绵羊体细胞克隆胚胎 激活方式，在体内培养转基因绵羊克隆胚胎，利用转基因克隆技术生产转TLR4基因绵羊。 材料与方法 将克隆的绵羊TLR4基因连接到改造的p3S．LoxP表达载体上，脂质体转染黑萨福克绵羊 胎儿成纤维细胞，通过实时荧光定量检测了TLR4基因的mRNA表达。分别获得体内和体外 M II期卵母细胞，利用核移植技术生产转TLR4基因绵羊胚胎，重构胚胎经延迟激活后移植 blot检测。剪取耳 受体，移植胚胎为1．8细胞期。提取出生绵羊耳部基冈组，进行Sou历ern 部组织，石蜡切片，免疫组化观察TLR4基冈的蛋白表达。‘ 结果 9只转TLR4基因绵羊出生，转TLR4基因克隆绵羊胚胎的生产效率为3．98％。克隆胚胎 II期卵母细胞 经延迟激活后融合率(68．45％)与囊胚率(13．93％)显著高于直接激活组，体内M blot II期可口母细胞；转TLR4基因绵羊经Sou历em 构建的重构胚胎融合率(78．82％)高于体外M 鉴定为阳性；免疫组化观察TLR4基因在阳性绵羊耳组织中的蛋白表达。 讨论 转基因抗病育种是通过转基因技术增强动物机体免疫力，提高抵抗细菌和病毒的攻击能 力。可通过过表达相关抗病基因和RNAi使易感基因沉默，也可利用基因敲除来达到抗病目 的。造成体细胞核移植成功率低的首要原因是供体细胞核未能完全再程序化。克隆胚胎的融 合与激活是影响克隆胚胎发育效率的关键环节。激活有融合同时激活…和融合后延迟激活12J， 核注射和重构胚胎的激活时间间隔影响胚胎的发育，融合后延迟激活法可获得更多的囊胚。 使供体细胞核与受体卵胞质充分的相互作用，但延迟过长时间激活的胚胎的发育能力会降低 13l。本试验选择融合后延迟2小时激活绵羊克隆胚胎，其融合率、囊胚率显著高于融合同时 激活组，延长核质作用时间能够提高胚胎的发育能力。 参考文献 X andthe transfered Jeta1．Nuclear ofnuclear remodeling potential porcine 【1]Yin developmental under OOCytesdelayed-activatedconditions．Zygote，2003，11(2)：167—174． T，KuromeM，Murakami ofthe human 【2]Fujimura