液相-2010中国药品检验标准操作规程(杂质检测,流动相比例调节).ppt

中国药品检验标准操作规程2010年版 高效液相色谱法 1、对仪器的一般要求 所用仪器为高效液相色谱仪，由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成 ，仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定期检定并符合有关规定。 1.1 色谱柱 最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶 。反相色谱系统使用非极性添充剂 ，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等）也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换色谱使用离子交换填充剂；分子排阻色谱使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。 1.2 检测器 最常用的检测器为紫外检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 1.3 流动相 反相色谱系统的流动相首选甲醇-水系统（采用紫外末端波长检测时，首选乙腈-水系统），如经试用不合适时，再选用其他溶剂系统。应尽可能少用含有缓冲液的流动相，必须使用时，应尽可能选用含较低浓度缓冲液的流动相。由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。 2、系统适用性试验 色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个参数。其中，分离度和重复性尤为重要。 按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行调整，以符合要求。 2.1 色谱柱的理论板数(n)。 用于评价色谱柱的分离效能。由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质，一般为待测组分或内标物质的理论板数。 在规定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留时间t R（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和峰宽（W）半峰高宽（Wh/2 ），按n＝16(t R/W)2或n=5.54(tR/Wh/2)2计算色谱柱的理论板数。 2.2 分离度（R） 用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的分离度，对色谱系统进行评价与控制。 无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另有规定外，待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。 2.3 重复性 用于评价连续进样后，色谱系统响应值的重复性能。采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0％；采用内标法时，通常配制相当于80％、100％和120％的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应不大于2.0％。 2.4 拖尾因子（T） 用于评价色谱峰的对称性。为保证分离效果和测量精度，应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定。拖尾因子计算公式为： T＝W0.05h/2d1 式中, W0.05h 为5%峰高处的峰宽；d1为5%峰高出峰顶点至峰前沿之间的距离。 除另有规定外，峰高法定量时T应在0.95～1.05之间。 峰面积法测定时，若拖尾严重，将影响峰面积的准确测量。必要时，应在各品种项下对拖尾因子做出规定。 3、测定法 3.1 内标法 按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子 校正因子（?）＝（AS/CS）/(AR/CR) 式中 ,AS 为内标物质的峰面积或峰高；AR为对照品的峰面积或峰高；CS为内标物质的浓度；CR为对照品的浓度。 3.2 外标法 按各品种项下的规定，精密称(量)取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算含量： 含量（CX）＝CR(AX/AR) 式中各符号意