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实时定量检测肝癌组织中墙粒酶hTERT基因表选 325 实时定量检测肝癌组织中端粒酶hTERT基因表达 高劲松周昕煦仝明何蕴韶周远帆冯启龙 端粒酶活性是细胞永生化的关键步骤，人体绝大多数恶性肿瘤平均85％以上存在端粒酶 活性，而在正常的组织中无端粒酶活性“。J。在肝癌中端粒酶活性高达80％以上，活性一般较 高，并且证实活性越高复发率也越高，同样在急慢性肝炎、肝硬化中发现有较低的端粒酶活 性”1，因此，定量检测端粒酶活性对肝癌的诊断，预测肝癌术后的复发有重要的临床意义“j。 目前检测端粒酶活性常用(telomeratic repeat amplification 产物污染导致假阳性、定量不准等问题。端粒酶逆转录酶(telomera∞llffverse transcfiptanse， hTERT)或称端粒酶催化亚基已证实是端粒酶组分中最关键的限效因子，它的表达水平同端粒 酶活性密切相关，定量检测h3ERT基因的表达水平，可反映端粒酶的话性高低”04]。我们采 用新近出现的基因定量方法——实时定量RT—PCR方法，对50例肝癌及癌旁组织中的端粒 hTERT基因表达水平，从而提供一种检测新的肿瘤标志基因的方法。 被料|方法 (一)细胞培养 并台青链霉索双抗各100 U／ml的培养基中，5％C02孵箱37℃恒温常规培养，收集并计数肿瘤 细胞，置一80℃冰箱备用。 (=)组织标本 立即将标本放人液氟中，然后放入一80。C冰箱备用，所有标本均作病理检查确诊。病人年龄 26—72岁(平均48．1岁)，男性46例，女性4例。 (三)细胞与组织总RNA的提取 ml 将l旷一107细胞株或上述手术后的肝癌及癌旁组织0．1—0．2g，分别加人1 Trizol(Gib． A280比值≥2．0，并计算出RNA含量，然后置一800C冰箱备用。 (四J引物、探针设计、合成、纯化 本课题受国家科学技术部项目资助(国科生字[meo]142号) 作者单位：510089广州，中山医科大学达安基因诊断中心(高颈松何蕴韶周远帆)；中山医科大学肿瘤防 治中心(仝明冯启龙) 中嗣癌症研究进展@ CACTGTCITCCC,C㈨GTIEAC一3’扩增片段长度为95 PE公司产 针合成纯化在我们实验室完成。 (五)eDNA合成 在反应体积为20 nunol／L m逆转录管中，含2旭提自细胞株总RNA或病人肿瘤标本，50 mmol／L nu∞l／LfliT，0．01％BSA，1dNTPs， Tris—el(pH8．3)，40mnlDl／LKCI，7mmoi／LMsCli，1 20U URNA酶抑制剂(华美公司产品)，10 MMLV逆转录酶(Sangon产品)，lO pmol／L端粒酶 hTERT下游引物，”℃，60rain，95℃5min灭活逆转录酶。合成好的eDNA置一20℃备用。 (六)定量阳性标准模板的克隆 95 采用T—A载体克隆方案，将端粒酶hTERT T载