生物分离-预处理.ppt

生物分离的前处理 ——发酵液的预处理 2.发酵液的预处理 2.1 发酵液的特性和预处理的目的 2.2 预处理——加热 2.3 预处理——调节pH值 2.4 预处理——加入助滤剂 2.5 预处理——加入反应剂 2.6 预处理——凝聚 2.7 预处理——絮凝 2.1 发酵液的特性和预处理的目的 无论产物在胞内还是在胞外或是菌体本身，都首先需要进行发酵液的预处理和固液分离，以使产品可以从澄清的发酵液中提取，或是从收集的固体（菌体）进行破碎、提取分离胞内的产物。 微生物发酵液的特性： 发酵产物浓度较低，大多为1～10％，有的甚至更低，悬浮液中大部分是水； 悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大； 固体粒子可压缩性大； 经常含有一些粘性物质，如蛋白质、核酸和多糖等，液相粘度大，大多为非牛顿型流体； 性质不稳定且随时间变化，如易受微生物污染、空气氧化、蛋白酶水解等作用的影响。 这些性质使得发酵液的过滤与分离相当困难!!! 预处理的目的 改变发酵液的物理性质(黏度↓、颗粒↑、颗粒稳定性等)，固液分离速度↑ ，分离器分离效率↑ ； 目标产物转移其中一相(多数为液相)； 去杂质 发酵液预处理的主要方法 2.2 加热 一般加热的温度采用65—80℃。不同的蛋白质其开始变性沉淀的温度不同。最简单也是最廉价的发酵液预处理方法。通过对发酵液进行加热处理可以达到几个目的： 降低发酵液粘度，改善固液分离条件； 除去部分热敏性的杂质，如杂蛋白；同时，在适当温度和受热时间下可使发酵液中的蛋白质由于变性而凝聚，形成较大颗粒的凝聚物，发酵液的粘度就会随之降低，进一步改善了发酵液的过滤特性。 使发酵液获得巴氏灭菌的作用。 前提是目的产物必须为非热敏性的。 缺点： 热处理常常会对发酵液质量有些影响，特别是会使色素增多。而且，温度升高常使发酵液中的一些水解酶活力升高，被分离产物有受酶水解的危险。 因此，热变性最好在硫酸铵溶液中进行，另外，选择合适的缓冲液、pH、加热方式和加热过程也很重要。 新进展： 为了提高产物在下游提取过程中的活力稳定性，人们对耐高温型的基因工程产品（如蛋白酶等）的关注也日益加强，不断有耐高温的基因工程产品出现，这也使得采用升高温度的处理方法可行性和可操作性更强。而且，原来为了防止产品失活（需要控制在低温条件下操作）而消耗的制冷能耗也可以节省，并简化了分离步骤。 2.3 调节pH值 适当的pH值可以提高产物的稳定性，减少其在随后的分离纯化过程中的损失。例如，在毕赤酵母表达体系中，由于毕赤酵母分泌的蛋白酶会分解表达的基因蛋白，所需蛋白的收率受到很大的影响，如果调整pH至酸性则可有效抑制蛋白酶的活性，目的蛋白的收率能够增加。 注意：你的蛋白在这个pH下是否稳定？ 大多数蛋白质在pH5～9范围内比较稳定，超出这个范围就可能会发生变性。酸和碱都能使蛋白质发生变性（可逆变性或不可逆变性），在温和条件下为可逆变性，在强酸、强碱条件下则为不可逆变性。这是因为蛋白质是氨基酸聚合物，在肽链的不同部位上带有不同电荷的基团，这些基团之间静电引力形成的键维持着天然蛋白分子的构象。酸和碱的作用，使蛋白质分子内的基团带电性质发生变化，从而破坏了静电引力所形成的键，同性相斥的结果使原来的构象发生了变化。 蛋白质pH变性的速度与蛋白质分子质子化（或非质子化）的速度无关，它取决于该蛋白质结构趋向松散的速度。因此温度也是一个重要的影响因素，pH变性时的温度一般控制在0～10℃之间。pH变性比热变性更安全可靠，它能迅速达到或偏离特定的pH值，放大操作很方便。 在调节pH值时要注意，应选择比较温和的酸和碱，以防止局部过酸或过碱。调节pH5～8.8范围常用Tris和醋酸，调节pH4.0左右常用乳酸，更低的pH可用磷酸或硫酸；草酸也是一种较常用的酸性pH值调节剂。调节pH9.0左右可用二乙胺，调节pH9.5左右用碳酸钠，更高的pH值可用氢氧化钠或氢氧化钾。 2.4 加入助滤剂 助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，在发酵液中添加助滤剂后能使滤饼疏松，滤速增大。这是因为使用助滤剂后，悬浮液中大量的细微粒子被吸附到助滤剂的表面上，从而改变了滤饼结构，形成更多的可透过通道，它的可压缩性下降了，过滤阻力降低了。助滤剂尤其适用于处理具有菌丝体的发酵液。 常用的助滤剂有硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、碳粒、磨碎木浆、淀粉等。 助滤剂的使用方法有两种：一种是在过滤介质表面预涂助滤剂，另一种是将其直接加入发酵液，也可两种