2013组织培养实验课.ppt

细胞培养实验  实验准备 实验用品： 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸 CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管 压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广 电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用干玻璃 器皿消毒 滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、 酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境 紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料 培养皿和培养板等表面消毒 超净台 超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 滤 器 CO2培养箱 CO2培养箱设定的条件为37 ℃ ，5％CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： ①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净。定期消毒 （90 ℃ ，14 h)。 ③箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。 自动双重纯水蒸馏器 纯水仪 酶标仪 微孔板震荡器 培 养 板 培养瓶 一、实验目的 掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作。 了解化学消毒法的使用方法。 了解传代细胞的传代方法及操作过程，学习观察体外培养细胞的形态。 了解细胞冻存和复苏操作过程。 二、实验原理 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 三、实验方法 1、玻璃器材的清洗处理方法 2、塑料器材的清洗处理方法 3、橡皮器材的清洗处理方法 4、金属器材的清洗处理方法 5、细胞的消化传代方法 方法 6、细胞的冻存与复苏 1、玻璃器材的清洗处理方法 清洁液浸泡或用2%磷酸三钠浸泡过夜 自来水冲10次 培养瓶再用三蒸水浸泡过夜 晾干 包装 灭菌 单蒸水洗2次 晾干备用 备用 刷洗 浸泡 2、塑料器材的清洗处理方法 用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡过夜 （单用或交叉处理） 水洗10次 单蒸水2次 紫外线或辐射灭菌备用 三蒸水浸泡过夜 晾干 刷洗 浸泡 3、橡皮器材的清洗处理方法 5%NaOH煮10 ′ ～20′ 水洗 4%盐酸煮10 ′ ～20′ 单蒸水洗三次、二蒸水洗一次晾干备用 水洗8~10次 刷洗 浸泡 金属器材的清洗处理方法 纸擦去表面的油脂 洗衣粉煮沸或用1%碳酸氢钠煮沸15分钟 水洗 95%酒精纱布擦干 包装灭菌 4、金属器材的清洗处理方法 吸除或倒掉旧培养液 加入2mL，无钙、镁PBS，漂洗一次后倒掉 加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液） 肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液 继续作用2～3分钟 显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立即终止消化 5、细胞的消化传代方法 加入完全培养基5mL，用吸管反复吹打 计数板计数 分瓶培养 细胞的消化传代方法 生长细胞形态 细胞冻存和复苏 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。 冻存和复苏的原则：慢冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 细胞冻存方法 1预先配制冻存液： 含20%血清培养基 10% DMSO 2 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml) 3