第四章色层分析法1.ppt

色层分析法 第三章 色层分析法 色层分析法提纲 吸附层析 分配层析 亲和层析 凝胶层析 实验技术 ●概述 色层分析法最早始于1900年。 1931年,R.Kuhn 等人分离复杂的有机混合物 1941年, 分配层析概念以及液-液分配层析的塔板理论。 1944年, 纸层析。 50年代开始, 出现了气相层析、液相层析、高效液相层析、薄层层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等,层析法和其它技术的联用。 茨维特的实验 色层分析法是由流动相，带着被分离的物质流经固定相，在移动过程中，各种溶质受到固定相不同程度的作用，从而使试样中的各种组分分离。 柱层析：固定相装填在管中成柱形，在柱中进行的层析分离； 纸层析：利用滤纸作为固定相的层析分离； 薄层层析：固定相在玻璃板、铝膜等支持物上铺成薄层的层析分离。 一．吸附层析（adsorption chromatography） 吸附 指在固体或液体内部或表面的选择性传递。 被吸附的物质称为溶质，固体材料称为吸附剂。 吸附层析 混合物随流动相通过由吸附剂组成的固定相时在固定相和流动相作用下发生吸附、脱附、再吸附、再脱附的反复过程。 1．原理 吸附层析是通过样品在固定相和流动相之间的吸附、脱附作用而实现分离的，这种吸附作用是一种物理吸附，通常是单分子层或双分子层或多分子层。 包括几种作用力，被分离样品与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间的静电引力，氢键、偶极分子之间定向力及范德华力等。 吸附等温线：在一定温度下，某种组分在吸附剂表面达平衡状态时在两相中浓度的相对关系曲线。 吸附等温线的斜率KD表示分配系数，Cs表示溶质在固定相中的浓度，Cm表示溶质在流动相中的浓度达到平衡时在固定相中的浓度 线形的吸附等温线 非线形的吸附等温线 2．吸附剂的选择 吸附剂的多孔结构，粒度和粒子形状是影响色层系统特性的基本因素。 几种常用的固体吸附剂 活化 吸附剂一般可分为极性和非极性两类。 极性吸附剂包括氧化物、氢氧化物和盐，在吸附过程中，离子与偶极、偶极与偶极的相互作用起主导作用。 非极性吸附剂如活性碳，硅胶等，吸附作用主要是色散力作用的结果。 影响吸附剂性质因素：化学结构、吸附剂的溶剂化作用以及吸附剂的预处理、吸附剂的物理状态 在选择吸附剂时，一般是根据吸附剂和被吸附物质理化性质进行的。极性强的吸附剂易吸附极性强的物质、非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。但是为了便于解吸附，分离弱极性的组分选用极性强的吸附剂，分离极性较强的组分应选用极性小的吸附剂。 （1）硅胶 硅胶是由聚硅酸脱水制得的颗粒状吸附剂 活化：在１０５～１１０℃加热３０min活化 不同形式（H/G/F） 粘合剂（煅石膏：牢度差，不能用于分离无机物；羧甲基纤维素：牢度好，不能用腐蚀性显色剂；淀粉：不能用于分离有机物） 　硅胶具有微酸性，可用于分离酸性和中性物质，如有机酸、氨基酸、甾体激素、类脂，萜类及色素等物质，硅胶用量一般是样品量的 ３０～３６倍。 （2）氧化铝 Al2O3是由Al(OH)３脱水制得，Al2O3表面存在铝羟基Al－ＯＨ，由于羟基的Ｈ键作用而能吸附其它物质。 Ａl2O3可分为中性、酸性、碱性三种。 中性氧化铝适用于醛、酮、酯、内酯化合物及某些苷的分离； 酸性氧化铝适用于酸性化合物，如酸性色素、某些氨基酸， 以及对酸稳定的中性物质的分离； 碱 性Ａl2O3适用于分离碱性化合物如生物碱、醇以及其它中性和碱性物质。 一般讲，能用酸性或碱性氧化铝分离的物质也可 用中性的氧化铝分离。 一般Ａl2O3用量为样品量的5～２０倍。 （3）羟基磷灰石 在使用HA作为固定相基质时，有几点应注意： i) HA系干粉末时，要先在蒸馏水中浸泡，使其膨胀度（水化后所占有的体积）达到2～3mL/g后，再按1:6体积加入缓冲液（如0.01mol/L NaP(磷酸钠缓冲溶液)，PH6.8）悬浮，以除去细小颗粒。 ii) HA悬浮液须用漩涡振荡器混合，若用磁棒或玻璃棒搅拌时，HA的晶体结构会受破坏。 iii)忌用柠檬酸缓冲液和PH5.5的缓冲液。当用过的HA层析柱再生时，要先挖去顶部的一层HA，然后用一倍床体积1mol/LNaCl溶液洗涤，接着用4倍床体积的平衡液洗涤平衡，如此处理后即可使用。 iv)就操作容量来说，一般细颗粒HA比粗的大；从分辨率比较，粗颗粒HA也没有细的好。但是用细的颗粒层析时，柱子直径大些才能达到满意的流速。 参考书：《生物化学技术原理及其应用》 P45～P46 （4）聚酰胺 由己内酰胺聚合而成，层析用聚酰胺是白色多孔性的非晶形粉末，对碱比较稳定，对酸的稳定性较差。