WB操作步骤及经验.pdfVIP

个人整理 Western Blot （步骤简略，但注意事项、经验总结、基本原理很全面 1、 丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热( 以利于溶解双丙稀酰胺) 的去离子水配制含有29%(w/v) 丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O 至100ml。)储于棕色瓶，4 ℃避光保存。严格核实PH 不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化 或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。 2、 十二烷基硫酸钠SDS 溶液:10%(w/v)0.1gSDS ，1mlH2O 去离子水配制，室温保存。 3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris 和48ml1mol/LHCL 混合，加水稀释到100ml 终体积。过滤后4°C 保存。 4 、 浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris 溶于40mlH2O 中，用约48ml 1mol/L HCL 调 至pH6.8 加水稀释到100ml 终体积。过滤后4°C 保存。这两种缓冲液必须使用Tris 碱制备，再用HCL 调节PH 值，而不用Tris.CL 。 5、 TEMED 原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH 太低时， 聚合反应受到抑制。AP 提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制. 6. 10%过硫酸铵溶液： 称取1g 过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至 10ml，分装到 1.5ml 微量离心管 中，冻存。 7、 SDS加样缓冲液:在沸水终煮3min 混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。 8 、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g 甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至 1000ml，临用前稀 释10 倍。PH8.3 9 、 转移缓冲液： 2.9g 甘氨酸、5.8gTris 碱、0.37g SDS （可不加），200ml 甲醇（临用前加），加水 至总量1L。 10、 丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸 30g 磺基水杨酸 30g 加水至 100ml 用时上述储存 液稀释10 倍即成丽春红S 使用液。使用后应予以废弃。 11、 脱脂奶粉5%(w/v) 。 12、 NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作) ，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS) 。 4.2.4 22. 聚丙烯酰胺凝胶溶液： 分离胶12.5% , PH8.8 5ml 10ml 15ml 超纯水 1.5ml 3.0 ml 4.5 ml 30%丙烯酰胺溶液 2.1 ml 4.2 ml 6.4 ml pH8.8、1.5mol/LTris 溶液 1.3 ml 2.6 ml 3.8 ml 10%SDS 0.05ml 0.1 ml 0.15 ml TEMED 0.002ml 0.004 ml 0.006 ml 10%过硫酸铵 0.05ml 0.1 ml 0.15 ml 浓缩胶：5% ，pH6.8 2 ml 4 ml 6 ml 超纯水 1.4 ml 2.8 ml 4.1 ml 30%丙烯酰胺溶液 0.3 ml 0.6 ml 1.0 ml pH6.8、1.0mol/LTris 溶液 0.25 ml 0.5 ml 0.75 ml 10%SDS 0.02 ml 0.04 m 0.06 ml TEMED 0.002 ml 0.004 ml 0.