PyroMark ID 演示.ppt

Pyrosequencing? Technology- PyroMarkTM ID DNA分析系统 Jiabing Cao Application Department Gene Company Ltd Biosystems head office in Uppsala, Sweden PyroMark Platform Pyrosequencing焦磷酸测序技术的特点 唯一得到定量序列结果的技术 极高的准确性 Built-In QC 重现性极佳 通用型技术平台 功能多样，应用领域极广 可以用于任何遗传多态性的分析 甲基化研究的最佳平台 高通量、低成本的快速临床微生物诊断 实验设计灵活 自动化程度高，操作简单 As easy as PCR， as reliable as sequencing 强大的技术支持 PCR Reaction PCR产物长度，最好在200bp以内 PCR Primer之一标记生物素，使用HPLC纯的生物素标记引物 生物素标记的引物量不要过多（10pmol in 50uL PCR reaction） ，否则会干扰结果 50uL体系，做50个循环，一般建议10ng Genomic DNA 可以在agarose胶上检测PCR产物，需要得到单一、较强的条带 分离纯化单链－设备 分离纯化单链 准备试剂 试剂存放 把试剂加入试剂舱 根据每次实验的样品，按软件给出的需要试剂的体积分别加入到试剂舱中，加入试剂时注意：把试剂舱的标签面对自己，按下图所示的孔位置加入，千万不能加错位置。 Pyrosequencing 测序反应 打开仪器，仪器需要预热90min，所以应早点打开 打开电脑和软件 设定SNP entry，设定的是所分析的序列信息（SNP Simples Entries New Entry ) 设定SNP Run，设定本次反应的信息，如反应孔以及反应每孔的样品（SNP SNP Run New SNP Run) 把经过试样预处理的PSQ96板放置在仪器上，把加好试剂的试剂舱放置在仪器上，试剂舱放置时应把有标签的一面对外 测序反应 PyroMarkTM ID SNP software SNP Entry 用户建立SNP/突变序列数据库 输入待分析的序列，如： A/GGGCAGATCCTTG……. 软件自动计算各种基因型的理论结果 Set up a run During the run Quality assessed data After run 立即清洗试剂舱，清洗得当的情况下，可以重复使用20次，在试剂舱标出使用的次数 如果两周以上不会再使用仪器的话，则关闭仪器，否则的话，使仪器保持打开状态（关机时注意：先通过软件关机，再关闭仪器上的电源） 退出PyroMarkTM ID软件 如实验中有液体溅出，请清洁仪器 Pyrosequencing在微生物领域的应用 Conventional vs Molecular methods 传统方法——表型测试 需要培养 耗时长 受环境的影响，变数多 判断困难，有时需倚仗经验，有主观性 有一些微生物培养上很复杂，难以鉴定 分子方法 无需培养 快速准确 即便是死样本也可以进行分型 PyroMark ID：Approach 确定研究对象及相关种群 寻找特征 ? 差异基因 16S rRNA, 18S, 23S rnpB rpoB inlB Assay Design Software：在目标基因的保守区设计PCR及测序引物 焦磷酸法测定可变区序列 IdentiFire Software：与数据库比对，确定分型结果 细菌综合分型 16S rRNA gene是细菌分型中使用最为广泛的目标基因 对16S rRNA gene可变区V1和V3进行扩增后用焦磷酸法测序 PCR 及测序引物则设计在两侧的保守区中 属内相似种的鉴定 分支杆菌由于其生长缓慢,以及许多品种间表型相似，常规表型鉴定的手段很难来鉴定其中许多种。 16S rRNA rnpB gene used for typing rpoB gene used for Rifampicin resistance analysis 微生物抗药性分析 Rifampicin（利福平）——mutations in the rpoB gene Isoniazide（异烟肼）——mutations in the katG gene Fluoroquinolones（对苯二酚）——gyrA Linezolide(利奈锉氨 ) resistance mutations in 23S Ethambutol （乙胺丁醇）——embB 病毒鉴定及分型 Human papilloma virus