分子生物学实验理论与操作教程.doc

分子生物学实验理论与操作教程 分子生物学实验理论与操作教程 中国农科院研究生院 中国生化及分子生物学学会 植物病虫害生物学国家重点实验室 二零零四年七月 目 录 前 言I 第一部分 核酸提取1 实验一：基因组DNA提取1 实验二：总RNA提取3 第二部分 亚克隆技术8 实验三：质粒DNA提取8 实验四：DNA片段的酶切9 实验五：DNA片段的酶修饰-脱磷12 实验六：DNA片段的连接13 实验七： DNA片段的回收15 第三部分 PCR技术18 实验八：PCR产物的克隆技术18 八．1：T-载体构建 19 八．2：PCR产物的T-载体克隆20 八．3：PCR产物的平端克隆技术21实验九：RT-PCR技术21 实验十：定量PCR 25 第四部分 文库构建技术29 实验十一：mRNA的提取及纯化 29 实验十二：cDNA文库构建技术- cDNA 链的反转合成32实验十三：1,cDNA文库构建技术- cDNA 链的连接、包装及转染34 实验十三：2,RACE技术36 第五部分 核酸杂交技术40 实验十四：DNA探针的标记40 实验十五：Southern杂交技术44 第六部分：基因及基因产物检测技术48 实验十六：DNA的测序技术48 实验十七：基因表达 1，基因的体外快速翻译53 2，基因的诱导表达54 实验十八：报告基因的应用57 实验十九：Western杂交技术58 第七部分 基因表达轮廓技术67 实验二十：DD-PCR技术73 实验二一：SSH技术74 第八部分：遗传转化技术75 实验二二：感受态细胞制备75 实验二三：重组基因的转化及筛选77 实验二四：原生质体分离78 实验二五：农杆菌转化技术79 第九部分：分子标记技术80 实验二六：RFLP技术86 实验二七：RAPD技术86 实验二八：AFLP技术87 实验二九：SSR技术89 第十部分：细胞技术89 实验三十：细胞凋亡89 十一：附录 一92 二96 第一部分 核酸提取 目的基因主要可以通过以下途径加以分离获取。对于序列已知或部分已知的寡聚核苷酸基因片断或基因可通过DNA的人工合成直接获取；或利用PCR、RT- PCR及RACE技术，直接扩增出相应的基因片段；对于未知序列的基因或基因片断利用dd-PCR等差异显示技术、转坐子标签技术、分子标记技术、图位克隆及电子杂交等手段分离出相应目的基因或探针片段，建立基因组文库或CDNA文库，再用探针从相应文库中钓相关基因。本部分主要介绍基因组DNA的提取纯化，RNA提取纯化等实验方法，其余内容见相应章节。 实验一:基因组DNA的提取 DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此DNA的提取也应是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作，如不能有效的完成DNA提取方面的工作，那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验。在DNA提取过程中应做到1,根据不同研究需要，保证结构的相应完整性；2,尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA等)；3,保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。下面结合不同的研究对象列出几种相应的DNA提取方法。 方法1，基因组总DNA的大量提取 本方法通过液氮研磨粉碎动植物组织、裂解液裂解细胞、有机溶剂抽提，使进入水相的核酸与蛋白成分分开，在RNA酶作用下，降解RNA，得纯度较高的DNA样品。 一：仪器 高速冷冻离心机、台式离心机、恒温水浴、低温冰箱或冰柜、冷冻真空干燥器、取液器、电泳仪、水平电泳槽、紫外观测仪 二：试剂 细胞裂解液（100mM Tris-HCl 5mM EDTA 500mM NaCl 1% SDS pH 7.5）；饱和酚；氯仿/异戊醇；异丙醇；70%及无水乙醇；3M NaAC（pH5.2）；RNA酶；TAE缓冲液；载样缓冲液 三:操作 动植物材料10g(鲜组织) 0.5g(干冻组织) 液氮,研碎 10ml裂解液(含1/10体积酚),(65℃预热), 加入等体积氯仿, 65℃放置30分钟， 间隔5－10min轻摇一次, 离心(12000-15000rpm, 15min ) 上清液 静止下 0.6体积冷异丙醇, 0.1体积3MpH5,2乙酸钠, 挑取絮状体, 70%冷乙醇洗涤,真空