温度梯度和程序升温：溶剂梯度和传统HPLC 技术的有效可靠的替代方法.doc

温度梯度和程序升温：溶剂梯度和传统HPLC 技术的有效可靠的替代方法摘要：迄今为止，程序升温液相色谱（TPLC）在色谱学工作者中并没有得到充分的应用。它能够分离各种样品（有机和无机）并提供极好的结果。在更高的温度下，由于背压的降低我们可以使用更小粒径的固定相填料来达到更高的柱效。同时，由于高温下流动相粘度的降低，我们还可以在更高的流速和更短的分析时间下进行分离。Thermal Gradients and Temperature Programming:Efficient and Reliable Alternatives to Solvent Gradients andTraditional HPLC Techniques Jody Clark Abstract:Temperature-programmed liquid chromatography (TPLC), hitherto an underutilized technique a mo ng chr om a to - graphers, offers excellent results for the separation of all kinds of samples, both organic and inorganic. Athigher temperatures, improved efficiencies can be achieved since backpressure is reduced, permitting the use of stationary phases with smaller particle sizes. Also, as a result of the reduced viscosity at higher temperatures, the separation can be operated at higher flow rates resulting in much shorter analysis times. 在现代实验室中, 程序升温液相色谱法(TPLC)对于分离科学家而言只是一种为获得最佳分离而提供额外价值的技术,而没有完全把它当作一种通用的和具有极高效率的方法使用。在进行色谱分离实验时,仪器和色谱柱的种种限制已经制约了温度成为一个具有重要意义的参数。我们争论的焦点主要集中在硅胶柱对温度的稳定性差以及缺少足够的色谱柱加热设备。此外, 温度大于200的操作还需要设计一种能够消除温度不匹配效应的流动相预加热器。我们这里讨论的需要使用高温进行分离实验的仪器可能对于更常规的应用是无价的。程序升温给分析带来的直接好处是分离性能和结果的改善。在较高的温度下,由于背压的降低,可以使用更小粒径的固定相填料来达到更高的柱效。同时这也允许我们使用更高的流速。由于温度逐渐增加的流动相以及在固定相中扩散速率的增加,Van Deemter 曲线将会趋于水平,因此可以多次在最佳流速下进行样品分析而获得在环境温度下达不到的分离效果。1 用温度梯度替代溶剂梯度图1 是利用等度流动相和温度梯度方法分离的镇静剂混合物。结果表明温度梯度方法可以替代许多溶剂梯度方法，从而使许多需要通过复杂梯度才能分离的样品只需通过等度模式就可以达到目的。我们是在一根H ypercarb 柱(Thermo Electron, Bellefonte,PA)上通过一个PolarathermTM柱温箱(Selerity Technologies Inc.,Salt Lake City,UT)使用50到150的温度梯度进行分离的。其他需要用到的仪器还包括CM4000 泵(Milton Roy, Ivyland, PA)、真空脱气机(Alltech, Deerfield, IL)、UV200 可变波长检测器(Thermo Separations,Waltham, MA),和自动进样器(Alcott, Norcross, GA)。流动相是由50:50 的乙腈和pH 9.0 的醋酸铵缓冲盐组成。5μ L 的样品在1.0mL/min的流速下注入。开始时，温度在50下保持2min,然后以30为间隔逐渐上升到150并保持10 min。 我们在相同的仪器上使用PRP - 3 柱（Hamilton, Reno, NV）进一步分离了标准蛋白质。同时，也采用了等度流动相和温度梯度。流动相是25 : 75 的乙腈和含有0.1% 三氟乙酸（TFA）的水组成。5μ L 的样品在1.0 mL/min的流速下注入。温度以30的间隔从40逐渐上升到150 并保持5 min。5 种标准品在大约6 min 内获得基线分离，如图2 所示的色谱图。流动相粘度的降低就意味着流动相的流速对一根长为2.1 mm 并