PCR技术分离目的基因.ppt

* 第二节 PCR技术分离目的基因 一 PCR技术 1 PCR的含义 PCR（polymerase chain reaction）：模仿细胞内发生的DNA复制过程，体外大量合成目的DNA片段，包括变性、退火、延伸三个步骤。 2 PCR反应程序： （1）90－95℃模板变性 （2）37－60℃引物与模板复性（退火） （3）70－75℃引物延伸，合成模板链DNA的互补链 循环25-35次 加热 变 性 复性 复温 DNA的变性和复性 加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。 解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。 Kary B. Mullis（1944－） 引物 引物 Mullis’idea DNA聚合酶 DNA聚合酶 特定DNA片段 1983年 Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 酶活性(%) 温度(℃) 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 3 PCR反应体系的组成 1）DNA模板 2）引物 引物是指与待扩增的靶DNA两端序列互补的人工合成的寡聚核苷酸（15－30bp）。 3）dNTPs 4）耐热性DNA聚合酶 5）反应缓冲液 PCR引物的设计原则: 1.引物的特异性?引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。?2.长度?寡核苷酸引物长度为15~30bp。 3.G+C含量?G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。? 4.碱基础随机分布?引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。?5.引物自身?引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。 6.引物之间?两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。? ? 逆转录PCR (RT-PCR) 将mRNA逆转录与PCR技术相偶联的一种基因分离技术。 二 PCR技术分离目的基因 ＲＴ－ＰＣＲ 逆转录酶 ＤＮＡ聚合酶 mRNA cDNA 杂化双链 PCR扩增 RACE（Rapid amplification of cDNA ends） cDNA末端的快速扩增技术，是以mRNA为模板合成cDNA第一条链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3’或5’端之间未知序列的方法。 3’-RACE 5’-RACE 思考题： ? 1 什么是PCR？PCR包括哪三个基本步骤，各步骤的反应温度有什么特点？ 2 PCR反应体系有哪些重要组成成分？什么是引物？引物有哪两种类型？ 3 什么是RACE？它包括了哪两种PCR反应？ 目的基因的分离技术： 基因文库技术 PCR技术 插入突变法分离目的基因 图位克隆法分离目的基因（chromosome walking） 酵母双杂交技术分离目的基因 基因芯片技术 蛋白质组学技术 . . . . *