第五章酶与细胞的固定化.ppt

第五章 酶与细胞定化 固定化酶（Immobilized Enzyme）是20世纪60年代发展起来的一项新技术。以往使用的酶绝大多数是水溶性的酶。这些水溶性酶催化结束后，极难回收，因而阻碍了酶工业的进一步发展。60年代后，在酶学研究领域内涌现出固定化酶。它是通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用。过去曾称其为水不溶酶或固相酶。1971年第二届国际酶工程会上正式建议采用固定化酶的名称。 从60年代起，固定化酶的研究发展很快，起初人们把注意力集中在酶的固定化方法研究上，近年来，不但固定化方法和载体开发有了长足发展，而且已转向它在工业、医学、化学分析、亲和层析、环境保护、能源开发以及理论研究等方面的应用研究。 第一节 酶和菌体固定化 一、固定化酶与固定化细胞的优缺点 1.固定化酶的优点： （1）极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺。 (2) 可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化。 （3）酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化。 （4）在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。 （5）较能适应于多酶反应。 （6）酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低。 2.固定化酶的缺点: （1）酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本，使工厂开始投资大。 （2）比较适应水溶性底物和小分子底物。 （3）与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经分离后，才能固定化。 3．固定化细胞的优点 (1)省去了酶的分离手续，为多酶系统，无须辅因子再生。 (2)细胞生长快、而且多、反应快。 (3) 可以连续发酵，节约了成本，而且在蒸馏和提取前不用分离去细胞，能一边排出发酵液，一边进行培养，排除了产物抑制和消耗。 (4) 保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定，特别是对污染因子的抵抗力增加。 4.固定化细胞的缺点： （1）必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。 （2）必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其他酶的活性，以阻止副产物的形成。 （3）细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散。 二、酶的固定化方法 酶的固定化方法有： 1.吸附法 2.共价键结合法 3.交联法 4.包埋法 （图5-1）。 1.吸附法 吸附法分为物理吸附法和离于交换吸附法 （1）物理吸附法 通过氢键、疏水作用和π电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上。从而制成固定化酶。常用的载体有： （1）有机载体 纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等 （2）无机载体 氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。 2．离子交换吸附法 这是将酶与含有离子交换基的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。酶吸附较牢，在工业上颇具广泛的用途。常用的载体有阴离子交换剂，如二乙基氨基乙基（DEAE）-纤维素、混合胺类（ECTEDLA）-纤维素、四乙氨基乙基（TEAE）-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、Amberlite IRA-93、410、900等。阳离子交换剂基，如羧甲基（CM）-纤维素、纤维素柠檬酸盐、Amberlite CG50、IRC-50、IR-200、Dowex-50等。 四、包埋法 包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂（包括交联剂）的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未受到化学反应，可以制得较高活力的固定化酶，对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适用的。但是，只有小分子底物和产物可以通过凝胶网络，而对大分子底物不适宜。同时，凝胶网络对物质扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低。 1.凝胶包埋法 凝胶包埋法是将酶分子包埋在凝胶格子中。 （1）聚丙烯酰胺凝胶包埋法 （2）辐射包埋法 （3）其他凝胶包埋法 2．微囊化法 此法是将酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊内。它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外环境直接接触，从而增加了酶的稳定性，同时，小分子底物能通过膜与酶作用，产物经扩散而输出。微胶囊的制备方法有5种。 微胶囊的制备方法： （1）界面沉淀法 （2）界面聚合法 （3）液体干燥法 （4）红血球包埋法 （5）脂质体包埋法 五、共价键结台法 共价键结合法 是酶蛋白的侧链基团和载体表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法。 优点：酶与载体结合牢固，酶不易脱落，但反应条件较激烈，酶易失活，同时，制作手续亦较繁琐。 （一