登革热病毒新型恒温扩增快速检测方法与研究.pdfVIP

·38· 登革热病毒新型恒温扩增快速检测方法研究 宋凌浩1，符丽媛1，孟家祺1，赵志田’，狄彪2，尤其敏3 1．苏州出入境检验检疫局，苏州215021；2．广州市疾控中心；3．杭州优思达生物技术有限公司 摘要：目的建立适合口岸现场使用的登革病毒核酸快速检测方法。为检验检疫基层实验窀开展筛选检测和监控工作提供有效的 技术手段。方法通过合成特异引物和探针，系统筛选，优化恒温扩增条件，建立登革病毒核酸快速检测方法。并测试其灵敏度和 特异性。结果DENV交叉引物恒温扩增方法灵敏度达到103拷贝／ml，反应特异．操作简便，不需要特殊设备，3h可报告结果。结 论本研究应用CPA技术对DENV的核酸进行扩增，并应用试纸条检测技术检测核酸扩增产物，检测时间短．特别适合于样本的野 外现场快速检测。 关键词：登革热；快速检测；CPA：恒温扩增 3’ 登革热是南登革病毒所致的一组虫媒性传染病，传播媒 相关序列并应用DNAMAN软件进行比对。确定选取DEN 介主要是埃及伊蚊、白纹伊蚊。登革热广泛流行于全球热带 UTR片断进行引物设计(表1)。 和亚热带地区，是最为严重的一种虫媒病毒性疾病。实现登 革热的快速检测对于预防病毒传染和疫情控制具有重要意 表1病毒扩增用引物 义。本课题应用交叉引物核酸恒温扩增技术建立的检测方 引物 引物序列 法用于快速筛选鉴别登革热病毒，为检验检疫基层实验室开 DFLF3ACTATGCTGCCTGTAGCTCC 展筛选检测和监控工作提供有效的技术手段。 DFLB3CTGGAATGATCCTGAGGAGAC DFLBIPCCACAAACCATGGAAGCTGT 1对象与方法 DFLFIPGGAAAGACCAGACATCCTGC 1．1材料试验共使用登革病毒l-4型参考毒株，均由广州DFLDR5BlBiotin—CACTACC,CCATGCGTACAGC 市疾病控制中心提供。RNA样品提取液；DENV交叉引物核DFLDF5FlFITC—CAAAAAACAGCATATI．cACGCT 酸恒温扩增检测试剂；SSC缓冲液等。 DFCB3TTCTG，rGCCTOGAATGATG 1．2方法 DFCF3AACCATGGAACCTGTACGC 1．2。1特异引物和探针的设计、合成根据相关文献报道，结 DFCBIP Premier 5．0针对DEN3’非翻译区设 合软件Oli905．0和Primer DFCDF5FF兀℃一ACTAGAGGTrAGAGCAGACC 计特异性引物和特异性探针。 DFCDF581BiOTIN—AAACAGCATATTCACGCTGGG 1．2．2标准检测物的收集收集DENV的标准毒株或地方株 DFCDF582BIdnN—CTACCGG玎ACAGCAGACCC 的核酸样本或灭活毒株。 1．2．3 目的片段扩增用外围引物进行RT—PCR扩增。 将引物组成2套反应体系(表2和表3)，进行恒温扩增检 1．2．4目的片段的纯化回收用DNA纯化试剂盒回收扩增 测。 产物中的目的片段。 1．2．5质粒的构建 表2 DEN检测体系I 1．2．5．1连接使用PromegapGEM-TEasy载体试剂盒，将 目的片段插入T载体，建立10“l连接反应体系。