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登革热病毒新型恒温扩增快速检测方法研究
宋凌浩1,符丽媛1,孟家祺1,赵志田’,狄彪2,尤其敏3
1.苏州出入境检验检疫局,苏州215021;2.广州市疾控中心;3.杭州优思达生物技术有限公司
摘要:目的建立适合口岸现场使用的登革病毒核酸快速检测方法。为检验检疫基层实验窀开展筛选检测和监控工作提供有效的
技术手段。方法通过合成特异引物和探针,系统筛选,优化恒温扩增条件,建立登革病毒核酸快速检测方法。并测试其灵敏度和
特异性。结果DENV交叉引物恒温扩增方法灵敏度达到103拷贝/ml,反应特异.操作简便,不需要特殊设备,3h可报告结果。结
论本研究应用CPA技术对DENV的核酸进行扩增,并应用试纸条检测技术检测核酸扩增产物,检测时间短.特别适合于样本的野
外现场快速检测。
关键词:登革热;快速检测;CPA:恒温扩增
3’
登革热是南登革病毒所致的一组虫媒性传染病,传播媒 相关序列并应用DNAMAN软件进行比对。确定选取DEN
介主要是埃及伊蚊、白纹伊蚊。登革热广泛流行于全球热带 UTR片断进行引物设计(表1)。
和亚热带地区,是最为严重的一种虫媒病毒性疾病。实现登
革热的快速检测对于预防病毒传染和疫情控制具有重要意 表1病毒扩增用引物
义。本课题应用交叉引物核酸恒温扩增技术建立的检测方 引物 引物序列
法用于快速筛选鉴别登革热病毒,为检验检疫基层实验室开 DFLF3ACTATGCTGCCTGTAGCTCC
展筛选检测和监控工作提供有效的技术手段。 DFLB3CTGGAATGATCCTGAGGAGAC
DFLBIPCCACAAACCATGGAAGCTGT
1对象与方法
DFLFIPGGAAAGACCAGACATCCTGC
1.1材料试验共使用登革病毒l-4型参考毒株,均由广州DFLDR5BlBiotin—CACTACC,CCATGCGTACAGC
市疾病控制中心提供。RNA样品提取液;DENV交叉引物核DFLDF5FlFITC—CAAAAAACAGCATATI.cACGCT
酸恒温扩增检测试剂;SSC缓冲液等。 DFCB3TTCTG,rGCCTOGAATGATG
1.2方法
DFCF3AACCATGGAACCTGTACGC
1.2。1特异引物和探针的设计、合成根据相关文献报道,结 DFCBIP
Premier
5.0针对DEN3’非翻译区设
合软件Oli905.0和Primer DFCDF5FF兀℃一ACTAGAGGTrAGAGCAGACC
计特异性引物和特异性探针。
DFCDF581BiOTIN—AAACAGCATATTCACGCTGGG
1.2.2标准检测物的收集收集DENV的标准毒株或地方株
DFCDF582BIdnN—CTACCGG玎ACAGCAGACCC
的核酸样本或灭活毒株。
1.2.3 目的片段扩增用外围引物进行RT—PCR扩增。
将引物组成2套反应体系(表2和表3),进行恒温扩增检
1.2.4目的片段的纯化回收用DNA纯化试剂盒回收扩增
测。
产物中的目的片段。
1.2.5质粒的构建 表2 DEN检测体系I
1.2.5.1连接使用PromegapGEM-TEasy载体试剂盒,将
目的片段插入T载体,建立10“l连接反应体系。
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