基孔肯雅病毒荧光定量PCR检测方法建立.pdf

·94· 基孔肯雅病毒荧光定量PCR检测方法的建立 胡健萍”，杨宇1，白琳’，姚李四1，魏莲1，杨志红1，王静 1．中国检验检疫科学研究院．北京100123；2．沈阳农业大学 摘要：目的建立一种快速、敏感、特异的实时荧光定量PCR方法检测基孔肯雅病毒。方法通过序列比对挑选H{基孔肯雅病毒基 因组中高度保守的序列，在此序列卜设计引物及Taqm”探针，建立实时荧光定PCR反应体系。结果经优化的荧光定量PcR方 法有较好的灵敏度和特异性，对阳性对照质粒标准品的灵敏度日丁达21 copied斗l，通过检测与传播媒介相似的日本脑炎病毒、黄热病 毒、臀革热病毒无交义反应。结论本方法的建立在基孔肯亚热的疾病防控方面有较好的应用前景。 关键词：荧光定量；PCR；基孔肯雅病毒；检测；交叉反应 有许多研究报道使用Real—timePcR枪测基孔肯雅病毒感染，本 基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus，CHIKV)是引起基孔肯 雅热的一种急性自然疫源性传染病毒，主要是受感染的动物 研究通过对Genbank上新公布的基孔肯亚基因组序列分析比 和病人通过埃及伊蚊、非洲曼蚊、非洲伊蚊、棕翅曼蚊等吸血 对，在El基因保守区设计引物和探针，建立了灵敏特异的基孔肯 传播给人类。基孑L肯雅病毒属于披膜病毒科甲病毒属，其基 亚荧光定量Real—timePCR检测方法。 因组为不分节段的正链RNA，含有3个结构蛋白(衣壳蛋白c、 1材料和方法 包膜蛋白El和E2)和4个非结构蛋白(nsPl、nsP2、nsP3和 1．1．主要试剂PremixEx PCR试剂盒。OnePrime． nsP4)。其中包膜蛋白El对其抗原性和分类学有重要意义，通 Taq Step RT—PCR试剂盒，EASYDilution购自宝生物工程(大连) 过病毒E1基阗的系统发生分析可将CHIKV分为3个组：第1Script 组包含了全部西非的分离株，第2组是亚洲分离株，东、中、南 有限公司，TIANamp病毒RNA提取试剂盒购白天根生化科技 部非洲的分离株构成了第3组。基孔肯稚热起初主要发生在 东、中、南，西部非洲，亚洲和印度也有报道。由于基孔肯雅热 探针、引物由宝生物公司合成。CepheidTubes购自天津仪美 的流行与生态环境、人类的易感性、蚊子的带病毒状态、适宜 公司。基孔肯亚病毒全基因组质粒由军事医学科学院惠赠； 蚊虫繁殖的条件、蚊虫传播病毒的能力，国内外人口的流动等 日本脑炎病毒、登革病毒、黄热病毒疫苗株由本室保存，健康 都有关联，同时不断地全球化进程加速了本病由流行区向菲 人血清来自北京丰台区疾病预防控制中心。 流行区传播。基孔肯雅热也逐步传人中国，并多次在非洲以 1．2方法 及亚洲的印尼、菲律宾、泰国、越南、缅甸和印度等地爆发流 行。基孑L肯雅热最初临床表现为发热，头疼，疲劳，恶心，发 孔肯雅病毒全基因组序列，运用DNASTAR软件进行序列比 疹，及严重的关节炎，这些临床特征与登革热和疟疾相似，且 Premier 传播媒介与登革热雷同．因此，许多基孔肯雅热被误诊为登革 目的基因，用设计软件Primer 5设计引物探针。基孔 病毒感染。因此迫切需要准确特异检测CHIKV的方法。 肯雅病毒的探针5’端标记的荧光报告基团是CY5，37端标 目前用于基孔肯雅病毒的检测方法已经有ELISA、免疫层记的荧光淬灭基团为IowaBlack。引物和探针由宝生物T程 析、免疫荧光抗体测定(IFA)、病毒分离、RT—PCR和Real—time(大连)有限公司合成。引物和探针的序列见表1，基孔肯亚 PCR等。培养细胞分离病毒空噬中和试验法为较敏感的方法， 病毒的3个组(