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5.3 血红蛋白的提取和分离[第二课时 教案](高中生物选修一教案系列).doc
课题3 血红蛋白的提取和分离
第二课时
生动 教师组织与引导 教图 复习提问:凝胶色谱法和凝胶电泳法有何区别?生答:略
师总结;从蛋白质分子的作用力看:凝胶色谱法依靠重力分离,凝胶电泳法依靠电场力分离;从洗脱的先后顺序看:凝胶色谱法首先洗脱出来的是大分子的蛋白质;凝胶电泳法首先洗脱出来的是小分子的蛋白质。
引言:血红蛋白的提取和分离的实验操作是怎样进行的呢?
--引导学生阅读教材P66实验操作,并完成学案:
二、实验操作:蛋白质的提取和分离一般分为四步:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
(一)样品处理
红细胞中有一种非常重要的蛋白质—血红蛋白,它有4个肽链组成,包括两个α肽链和两个β-肽链,其中每条肽链环绕一个亚铁血红蛋白基团,此基团可携带一分子氧或一分子的CO2。血红蛋白因含有血红素而呈现红色。
师讲述:猪、牛、羊或其他脊椎动物的红细胞中都含有大量的血红蛋白。因此,我们可以用猪血、牛血、羊血等用来提取和分离血红蛋白。
师:选用猪、牛、羊的血液来分离血红蛋白,有什么优点?
生答:没有细胞核,使分离过程中要除去的杂质大大减少,使实验更容易成功。
引言:提取和分离血红蛋白的第一步是收集血红蛋白溶液。即样品处理。包括三个步骤:
红细胞的洗涤。目的: 。
操作:血液样品(加入 ,防止 )
↓低速短时间离心(500r/min、2min)
红细胞液
↓加入生理盐水(质量分数为0.9%的NaCl溶液)、搅拌、低速短时间离心
重复洗涤三次
↓
红细胞(洗涤干净)
思考:①、红细胞洗涤的目的是什么?生答:去除杂蛋白。
②、获取血液样品时,在采血容器中要预先加入抗凝血剂柠檬酸钠,目的是什么?生答:防止血液凝固。
③、洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水?
生答:不能。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不致于使红细胞吸水破裂。在未洗净血浆中的杂质蛋白前,红细胞如果提前破裂,会使血红蛋白与杂质蛋白混合,加大了分离的难度。
④、洗涤时,要做到搅拌、低速短时间离心、 重复洗涤三次。如果洗涤次数过少,会出现什么结果?离心的目的是什么?离心速度过高和时间过长,又会出现什么结果?
生答:无法除去血浆蛋白;将血液分层,便于用胶头吸管吸出黄色血浆;使白细胞、血小板等一同沉淀,达不到分离的效果
2.血红蛋白的释放
操作:红细胞(洗涤干净)
↓加 和
红细胞破裂,释放出血红蛋白
↓
含血红蛋白的混合液
思考:在血红蛋白释放的过程中加入蒸馏水和甲苯的目的是什么?
生答:加入蒸馏水使红细胞吸水胀破,释放出血红蛋白;细胞膜的主要成分是磷脂,易溶于甲苯等有机溶剂。加入甲苯可加速红细胞的破裂,释放出血红蛋白。
3.分离血红蛋白溶液
操作:含血红蛋白的混合液
↓高速离心(2000r/min、10min)
溶液分层(4层,从上到下依次是:无色透明的甲苯层、白色的脂溶性物质沉淀层、血红蛋白溶液、其他杂质的暗红色沉淀物)
↓滤纸过滤,除去脂溶性沉淀层
↓分液漏斗
血红蛋白溶液(红色透明)
思考:获取血红蛋白溶液后,高速离心的目的是什么?
生答:经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开来,便于分离出血红蛋白溶液。
引言:获取血红蛋白溶液,下一步要对其进行粗分离。
(二)粗分离 方法:
目的:
原理:
操作:取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中,将其放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲认中(pH为7。0),透析12h。
思考:粗分离的方法、目的、原理是什么?
生答:方法是透析。目的是除去样品中相对分子质量较小的杂质。原理是透析袋能使小分子自由进出,而将大分子保留在袋内。
(三)纯化 方法: 目的: 。
1.凝胶色谱柱的制作(了解、学生自学)
2.凝胶色谱柱的装填
操作:交联葡聚糖凝胶(G—75)→用蒸馏水溶胀→凝胶悬浮液→倒入色谱柱内装填→连接缓冲溶液洗脱瓶→用磷酸缓冲液(物质
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