AEG1shRNA阻断AEG1对肝癌细胞BEL7402侵袭性的影响.pdfVIP

1338 主国耋生堂苤盍!!!!生!旦笙!!鲞 马 建 吕国悦 谢淑丽 耿亚军 王广义 (吉林大学白求恩第一医院肝胆胰外科，吉林 长春 130021) AEG一】一 应用pu6mRFP [摘要]目的探索星形细胞上调基因(AEG)．1．shRNA阻断AEG-1对肝癌细胞BEL一7402侵袭性的影响。方法 MMP9、血管内皮生长因子(VEcF)mRNA的表达；Millicell检测细胞侵袭能力。结果ju6mRFP BEL_7402的侵袭性及其相关基因的表达，AEG一1是有效治疗肝细胞癌的靶点。 [关键词]星形细胞上调基因(AEG)一1；；肝细胞癌；肿瘤；侵袭 肝细胞癌(Hcc)患者出现临床症状时多已处于病变晚期，照组，经pu6mRFP 即便是早期得到成功的手术治疗，但早期即发生肝内血行转 质粒组，经pu6mRFP 移，术后5年复发率高达70％¨。。。因此，寻找一个可以有效 shRNA组。每组设3个复孔，取处于对数生长期的细胞按2× 降低Hcc细胞侵袭性的治疗靶点，对Hcc治疗至关重要。星106／孔的细胞数接种于6孑L板内，铺板24h后按上述方法转 形细胞上调基因l(AEG一1)是近年发现的一个癌基因，存在于染，继续培养72h后荧光显微镜随机照相检测转染率。Trizol 多种肿瘤组织中，在肿瘤的形成、增殖、侵袭、转移、血管生成和 耐药性等过程中发挥重要作用一o。本实验中应用Rhoc．siRNA 各组细胞AEG一1 阻断AEG一1表达，研究该基因对Hcc细胞株BEL-7402侵袭性CAGCCTATCAAGACTC一3 的影响，进而为靶向AEG一1的治疗积累实验资料。 GTcAAGGAG一3’，177bp，退火温度61℃；内参照甘油醛一3一磷酸 l材料与方法 1．1 细胞及主要试剂 309 人HcC细胞株BEL一7402由及吉林省bp，退火温度68℃。反应条件如下：94℃预变性5min； 普外科实验室保存，DMEM高糖培养液购自Hyclone公司，胎牛94℃变性30s，退火30s，72cc延伸30s，AEG一1扩增35个循 marker 血清(FBs)购自天津TBD公司，RT—PcR试剂盒和DNA环，GAPDH扩增25个循环；72℃延伸10mi“；4℃保存。PcR AEG一1一shRNA由上海吉凯基 购自日本Takara公司。pu6mRFP 产物经1．5％琼脂糖凝胶电泳后拍照并行灰度值扫描，每组重 因化学技术有限公司构建，pu6mRFPscramble—shRNA由吉林大复3次，比较各组mRNA相对内参照含量变化(目的基因灰度／ 学第一医院肝胆外科谢淑丽博士赠送。p一肌动蛋白(p—actin)内参照灰度)。 鼠抗人一抗、羊抗鼠和羊抗兔二抗购自santa公司，AEG—l和B—1．2．3 actin兔抗人抗体购自博奥森生物技术有限公司。Millicell购自 弃去洗液并吸净残余的PBs液体。在培养瓶中加入400¨l蛋 Millipore公司，Matrigel购自BD公司。 1．2 方法 二钠(BcA)法蛋白定量。加入上样缓冲液，十二烷基硫酸钠一 1．2．1 细胞转染将处于对数生长期的BEL-7402细胞接种 于6孔培养板，待细胞密度达到70％左右时进行转染。3“g载将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，丽春红染色，含5％脱脂 ml 体DNA与DMEM培养基在1．5EP管中混合，总体积100¨l 加10“l转染试剂，混匀后室温下放置10min；弃掉6孔板中培 入1：250稀释的兔抗人AEG—l抗体杂交2h，PBs洗膜；加入