SAhIL21双功能融合蛋白的表达纯化及生物学活性检测.pdf

窑1240窑 南方医科大学学报(JSouthMedUniv) 2010;30(6) SA/hIL21双功能融合蛋白的表达尧纯化及生物学活性检测 法萍萍袁张 振袁李金龙袁胡志明袁高基民渊南方医科大学生物技术学院生物治疗研究所袁广东 广州 510515冤 摘要院 目的制备链亲和素 渊SA冤 标记的人白细胞介素21 融合蛋白 渊SA-hIL-21冤袁 检测其生物学活性遥 方法构建 hIL21-SA-pET21及pET24a-SA-hIL21 质粒袁利用大肠杆菌BL21渊DE3冤表达两种双功能融合蛋白袁并利用镍金属螯合 层析柱渊Ni-NTA冤纯化袁之后透析复性袁Westernblotting进行鉴定袁最后利用MTT法检测hIL21-SA及SA-hIL21融合蛋 白与抗CD3单克隆抗体渊anti-CD3冤共刺激人外周血淋巴细胞的增殖活性袁流式细胞仪分析两种融合蛋白对生物素化 的MB49 肿瘤细胞的锚定修饰效率遥结果hIL21-SA及SA-hIL21重组融合蛋白在大肠杆菌中实现了高效表达袁约占菌 体蛋白的30%袁经复性后hIL21-SA及SA-hIL21具有了双重活性袁即不仅可以与抗CD3单抗共刺激淋巴细胞的增殖袁 而且具有了SA介导的高效结合已生物素化的MB49 肿瘤细胞表面的功能渊表面修饰效率95.18%袁96.91%冤遥 结论本 实验成功研制了具有双重活性的hIL21-SA 及SA-hIL21融合蛋白袁两种融合蛋白的双功能活性无显著性差异袁该项研 究为SA/hIL21双功能融合蛋白应用于肿瘤疫苗以及肿瘤局部治疗奠定了基础遥 关键词院白细胞介素21曰链亲和素曰融合蛋白曰锚定 中图分类号院R392曰Q81 文献标识码院A 文章编号院1673-4254(2010)06-1240-04 Expression, purificationandbioactivityevaluationofstreptavidin-taggedhumaninterleukin- 21fusionprotein FAPing-ping,ZHANGZhen,LIJin-long,HUZhi-ming,GAOJi-min InstituteofBiotherapy,SchoolofBiotechnology,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China Abstract:Objective Toobtainstreptavidin-taggedhumaninterleukin-21(hIL21)fusionproteinandevaluateitsbioactivities. Methods hIL21-SA-pET21andpET24a-SA-hIL21plasmidswereconstructedandexpressedinBL21 (DE3) hostbacteria. ThehIL21-SAandSA-hIL21fusionproteinwerepurifiedthroughNi-NTAaffinitychromatographyandrefoldedbydialysis. FlowcytometrywasusedtodetecthIL21-SAandSA-hIL21fusionproteinonthebiotinylatedMB49tumorcells.MTTassay wasusedtoevaluatetheeffectofthefusion proteinontheproliferationofhumanperipheralbloodlymphocytes (PBLs) stimulatedbyAnti-CD3. Results TherecombinantfusionproteinswerehighlyexpressedinBL21(DE3)atabout30percnt; ofthetotalbacterialproteins. Thetwofusionproteinsexhibitedbifunctionalactivities, i.e. bothbiotin-bindingpropertyand hIL21activityandSA-mediatedhigh-affinitybindingtobiotinylatedcell surfaces (