TK基因转染骨肉瘤U2细胞体外实验研究.pdf

272 中国骨与关节杂志2012年6月第 l卷第3期 ch se』 ! 垦 些 !： !： ： ． 基础研究 Basicresearch- TK基因转染骨肉瘤U一2细胞体外实验研究 李晋惠 吕智 马卓 冯毅 王军 兰彦平 张桦栋 基金项 目：山西省 自然科学基金资助项 目(2007011112) 作者单位：030001太原，山西医科大学附属第二医院骨科 通信作者：吕智，E-mail：zhiLV_2002@yahoo．com．cn 【摘要】 目的 研究脂质体介导的TK／GCV系统对人骨肉瘤细胞的杀伤作用及其产生的旁观者效应。 方法 构建重组质粒pIRES—EGFP—tk，制备和转化感受态大肠杆菌BL21以及鉴定测序，提取、纯化重组质粒 DNA，培养和转染人骨肉瘤细胞株U一2OS，流式细胞仪分析和荧光倒置显微镜下观察细胞生长状态，用转染 后的培养液的上清加入TK(一)U一2OS中观察旁观者效应。结果 成功地构建出包含有TK基因cDNA片段的重组 质粒pIRES—EGFP—tk，通过PCR等方法鉴定质粒大小和位点均符合实验设计。荧光显微镜下观察U一2OS(TK+) 呈现绿色荧光。U一2OSTK／GCV培养上清液可明显诱导细胞凋亡。但将上清液用0．2gm的滤膜滤过后，诱导凋 亡作用消失。结论 成功构建重组质粒plRES—EGFP—tk，体外实验表明人骨肉瘤细胞系u一20S对脂质体介导 的TK／GCV系统敏感 ，并且有明显的旁观者效应，可望成为骨肉瘤基因治疗的新途径。 【关键词】 TK；基因转染；骨肉瘤；旁观者效应 DOI：10．3969~．issn．2095-252X．2012．03．012 TheexperimentalresearchontheosteosarcomaU-2cellstransfectedbythym idinekinasegeneinvitro LI Jinhui,L Zhi,MAZhuo．FENG ．WrANGJun．LANYanping,ZHANGHuadong．DepartmentofOrthopedics．The SecondHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan．Shanxi,030001．PRC 【Abstract】 ObjectiveTostudythekillingeffectsoftheliposome—mediatedthymidinekinase(TK)／ ganciclovir cv)systemonhumanosteosarcomaceilsanditsbystandereffects．MethodsTherecombinantplasmid plRES．EGFP．tkwasconstructed，andthenwaspreparedandtransformedintoEscherichiacoliBL21competent cells．Andthesequencingwasidentified．Therecombinantplasmiddeoxyribonucleicacid(DNA)wasextractedand purified，nadthehumna osteosarcomacelllineU一2osteosarcoma(OS)wasculturednadtransfected．Thecellgrowth statewasanalyzedbyflow cytometryandobservedunderinve~edfluorescencemicroscope．Aftertrna sfection．the supernatantofculturemedium wasaddedtotheTK (一)U．2OS，nadthenitsbystnadereffectswereobserved．ResuRs TherecombinnatplasmidplRES--EGFP·t·kcontainingcomplementarydeoxyribonucleicacid(cDNA)fragmentswith TKgenewassuccessfullyconstructed．Bysuchmethodaspolymerasechainreaction(PCR)