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体表粘液在赤子爱胜蚓抗菌免疫中的作用 1  *  王 冲，孙振钧  ，郑冬梅，黄健 （中国农业大学资源与环境学院， 北京 100094）  * 通讯作者，  E­mail：sun108@  摘 要：本研究探讨了体表粘液在蚯蚓抗菌生态免疫系统中的作用。结果表明：当浓度为 0.2g/mL 时，蚯蚓的体表粘液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为 1.22 厘米；其次为大肠杆 菌，抑菌圈直径为 1.13厘米，对绿脓杆菌的抑菌作用最差，仅为 0.98 厘米，诱导后蚯蚓体 表粘液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用显著增加，差异极显著（P＜0.01），但对 绿脓杆菌的抑菌作用没有显著增加。此外，本研究还从蚯蚓的体表粘液中分离出具有抗菌活 力和溶菌活力的凝集素粗品，含糖量为 1.66±0.16%，并且在细菌诱导后凝集素的含糖量显 著提高，为 3.75±0.13%，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活力增强。 关键词：赤子爱胜蚓；体表粘液；凝集素；抗菌作用  1.  引 言 鱼类和两栖类在长期的进化过程中， 为抵御有害环境因子的侵袭逐渐形成了一系列的保 护机制。其中，在它们的皮肤分泌液中存在各种各样与机体防御相关的物质，如能杀灭微生 〔， ， ， ， ， 〕 物、防御天敌的生物胺和活性多肽等 1 2 3 4 5 6 。并且在大肠杆菌诱导蚯蚓后，能够增加 表皮中大颗粒粘液细胞和网状细胞的分泌功能， 分泌出大量含有粘多糖蛋白液体复合物的粘 液，因此蚯蚓的体表粘液也可能在蚯蚓的抗菌免疫系统中发挥着重要作用。本实验对蚯蚓的 体表粘液的抗菌特性和蛋白质组成进行了初步分析， 并试图从体表粘液中分离纯化出凝集素 等活性物质，从而系统的阐明体表粘液在蚯蚓抗菌免疫中可能发挥的作用。  2. 材料与方法  2.1实验材料 蚯蚓为本实验室用腐熟的牛粪进行人工饲养的赤子爱胜蚓 （Eisenia fetida）。大肠杆菌、 绿脓杆菌及金黄色葡萄球菌均从中国科学院微生物所菌种保藏室购买，实验室扩繁后保存。 体表粘液的获得：选取成熟蚯蚓 （有生殖环，平均重量 0.3－0.5克）若干，放置在干净 的容器中，加适量生理盐水，15 分钟后吸取粘液，于 4℃  10000r/min 离心 30 分钟，取上清 液，即为蚯蚓的体表粘液，冷冻干燥后备用。  2.2蚯蚓体表粘液的抑菌实验 2.2.1 细菌诱导的实验方法  LB 液体培养基的配制：950 毫升重蒸水、10 克蛋白胨、5 克酵母浸粉、10 克氯化钠，  1  本课题得到中国高校博士点基金 （20020019029）；国家自然科学基金  资助。 ­ 1 ­  [7]  溶解后用 5M 的氢氧化钠调 pH 值至 7.0，加水至 1 升，100Pa 灭菌 20 分钟  。 细菌诱导：按 Sumida 等（1992）方法将大肠杆菌进行对数期培养。即将大肠杆菌接种 于 5mlLB 液体培养基上，37℃摇动过夜培养，将 0.2ml 菌液加到 5ml 新的 LB 液体中，同样 [8]  的温度下摇动 2 小时，此时的菌液即为对数生长期的大肠杆菌液  。再将对数期生长的大肠 5  杆菌液稀释到 1×10  个细菌/毫升后，把蚯蚓放在其中浸浴 4 小时。 2.2.2 抑菌实验 将  10ml  已高压灭菌的并冷却至  50℃左右的  LB  培养基倒入  9cm 培养皿中，然后将  5mLLB 培养基与 200μl 对数生长期的菌液快速混合均匀， 加入到已经铺有 10mLLB 培养基 的培养皿中。4℃冰箱过夜。第二天在培养皿中放入 3 个牛津杯。分别在牛津杯中加入 100  μl 浓度为 0