免疫共沉淀原理及注意事项.pptVIP

免疫共沉淀 （Co-Immunoprecipitation， Co-IP） 一 实验原理 以（抗体和抗原）之间的专一性作用为基础的用于研究（蛋白质相互作用）的经典方法。是确定两种蛋白质在完整（细胞内生理性）相互作用的有效方法。 如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。 CO-IP应用与IP区别 测定两种目标蛋白质是否在体内结合 确定一种特定蛋白质的新的作用搭档 CO-IP与IP只取决于检测焦点是初级靶分子（抗原）还是次级靶分子（相互作用蛋白） 实验基本原理 1.提取蛋白 2.在细胞裂解液中加入抗X的抗体 3.孵育后再加入Protein A或G(于Agarose bead上) 若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成复合物：“Y—X—抗X抗体—Protein A或G 3.经变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。（xy抗原、x抗体） CO-IP原理图解 proteinA/G-琼脂糖珠复合物 Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合。 目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上。 ProteinA/G的作用及具体原理 “捕获”抗体，形成复合物， 抗体-目的蛋白-ProteinA/G beads 非共价健结合 ProteinA/G-garose beads 共价结合 加样缓冲液-煮沸变性-离心 Protein A/G beads↓ EP管（抗体-目的蛋白-少量非特异性吸附蛋白）。 二 CO-IP特征 优点 （1 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态 （2 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响 （3 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物 二 CO-IP特征 局限性 （1 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用 （2 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，有第三者在中间起桥梁作用； （3 必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果。 三 实验流程 提取细胞总蛋白 ↓ ↓ 离心，上清电泳(抗原抗体) 准备PA珠子，PBS洗3遍 ↓ PA珠子加入蛋白裂解液（去除非特异性蛋白背景) ↓ 离心去PA珠子，取上清 ↓ 测蛋白浓度 (BCA法) ↓ 加一抗反应(4℃过夜) ↓ 加PA珠子捕捉复合物 (室温1h或4℃过夜) ↓ 离心，收集沉淀，预冷RIPA Buffer洗3遍 ↓ 上样缓冲液悬浮沉淀，加热游离抗原、抗体、珠子 ↓ ↓ 四 实验结果分析 SDSWestern blotting分析 质谱分析检测目的蛋白 SDS结果分析 标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。 CO-IP与质谱分析流程 三 实验的关键 1. 实验最需要注意点就是抗体的性质。特别是多抗的特异性是问题。 2. 为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。 3. 考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。 4. 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。？？ 注意的问题：1.裂解液 细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。 不能用高浓度的变性剂（0