单基因病的诊断4.ppt

单基因遗传病的诊断 基因诊断的难点：对大多数疾病尚未找到合适的基因诊断方法，另外由于遗传异质性、基因突变的多样性，一种基因诊断方法对同一疾病往往有很大差异。 基因诊断的对象：一般是指单基因病和某些有主基因改变的多基因病。 至1997年，发现人类单基因病遗传病已达8587种，现已达到15988种 进行基因诊断必须具备的条件： (1)致病基因的染色体定位已明确 (2)致病基因的结构、顺序与突变性质巳清楚 (3)致病基因与DNA多态存在连锁关系 根据所具备的条件选择适合的基因诊断技术 基因诊断方法 目前常用的基因诊断方法: (1)聚合酶链反应DNA扩增法 (2)限制性酶谱Southern印迹杂交直接分析法 (3)限制性片段长度多态性(RFLP)连锁分析法 (4)寡核苷酸探针(oligonucleotide probe)检测法 (5)DNA测序 (6)基因芯片 PCR的原理： 1. 为可选择性扩增,要有特异引物 2. 要有前身物、聚合酶和离子 3. 是链式反应，每一周期经过变性、复性和延伸三步 4. 一周期后DNA倍增 PCR的过程： 变性（92-95；1分钟） 复性（40-60；1分钟） 延伸（72；1.5分钟） DHPLC的特点： 1）快速分离DNA分子，一般进行基因突变检测，一个样品约需8.8分钟 2）自动化操作系统 3）准确测定DNA片段大小 4）基因突变检出率高，达95-100% 5）经济、操作简便、PCR产物无须进行纯化处理即可用于突变检测 Southern印迹杂交 (Southern blot hybridization) 原理: DNA碱基的替换和数目的改变可导致限制性酶切片段长度改变 1. 点突变至酶切位点消失或出现新切点 2. 较大片段碱基缺失 3. 串联重复数目较大的改变 4. 较大片段碱基重复 探针的种类和标记 探针标记(probe labeling) 同位素标记: 32P, 35S, 3H 非同位素标记: 生物素，地高辛 标记方法: 缺口平移 双链探针标记 随机引物 PCR 寡核苷酸标记: 5’末端标上标记物 1．限制性酶谱直接分析法： 应用专一性基因探针和限制性内切酶，经 Southern印迹杂交直接检测致病基因存在 原理： 限制性内切酶能识别 DNA中特定核苷酸顺序，在正常情况下某种限制性内切酶所切出的片段长度是固定的，当基因发生突变后, 核苷酸顺序发生改变, 导致限制性内切酶的酶切位点改变，从而使片段长度发生改变。 ASO点杂交(ASO dot hybridization) 　　　　(ASO: allele-specific oligonucleotide) 　能鉴定一对等位基因中单一核苷酸的差别 原理： 1. 点突变时突变点的碱基被替换 2. 设计分别与正常和点突变序列互补的探针 3. 单一碱基的不配对足以导致异源杂交链的结合不稳定 4. 严格的洗脱条件下,只有完全互补的异源杂交链能保留而显示杂交信号 5’ 3’ 3’ 5’ 变性 5’ 3’ 3’ 5’