丁醇发酵菌种的筛选及鉴定.pdf

丁醇发酵菌种的筛选及鉴定 摘要 目的： 以丁醇产生菌的生理特性与代谢特点，建立高效快速的筛选方法，从土壤及植物器官中筛选具 有较高丁醇生产能力的丁醇发酵细菌。对筛选到的菌株进行生理生化实验与 16S rDNA 鉴定，初步 鉴定确定其分类地位；考察该筛选菌的发酵特性，对其发酵条件进行优化，以进一步提高丁醇产量。 方法： 已知丙酮丁醇发酵细菌都是能产生耐高温芽孢的厌氧菌，通过热处理方法杀死细菌细胞以富集芽 孢，厌氧环境培养来淘汰好氧菌，涂布平板培养挑取单菌落分离纯化。对得到的单菌株进行发酵， 通过丙酮定性试验检测发酵液中丙酮含量，淘汰杂菌与溶剂产生能力弱的细菌。根据丁醇发酵过程 中前期产酸，后期将酸还原成丙酮、丁醇的特点，设计了溴甲酚绿平板鉴别产酸能力，美蓝褪色判 断还原能力的方法来筛选同时具有较强产酸能力和还原能力的细菌。最后对筛选到的少量菌株进行 发酵，通过气相色谱定量检测发酵液中的丁醇含量，得到最优菌株 sat3 ，对该菌株进行生理生化实 验和 16S rDNA 的27f—1492r 区段序列测序，将得到的序列在 GeneBank 的Blast 中进行相似比对， 下载相似最高的 8 个序列，通过 MEGA4.1 软件构件系统发育树，初步确定其分类地位，并优化其 发酵条件。 结果： 1、通过采集土样和马铃薯块茎，进行了丁醇生产菌的筛选。经过热处理富集、丙酮定性检测、 溴甲酚绿平板鉴别产酸能力和美蓝褪色还原判断还原能力，最后筛选到了 3 株菌株，再经过发酵检 测产物含量，得到菌株sat3 ，其丁醇产量为8.32g/L。 2 、对菌株 sat3 菌株进行了形态观察、染色反应和生理生化检测，初步确定其为梭菌属，再通 过扩增 16S rDNA 片段，比较相似性和同源性，结果证实了菌株sat3 属于梭状芽孢杆菌属。 3、对sat3 菌株的发酵条件进行优化，在初始pH 为5.5，玉米培养基浓度为7% ，发酵温度37 ℃ 时，丁醇产量较佳，可达9.10g/L。 结论： 1、利用热处理法能有效富集丙酮丁醇菌产生的耐热芽孢，淘汰不能产生芽孢的杂菌，达到富集 目的。 2 、通过丙酮定性试验可以检测发酵液体中丙酮存在与否，以及通过颜色深浅比较挑选具有较强 丙酮产生能力的菌株。 3、利用溴甲酚绿平板褪色情况可以鉴别菌株产酸能力强弱，利用美蓝褪色情况可以判断菌株还 原能力的大小，同时具备较强产酸能力和还原能力的菌株，具有较强的溶剂生产能力。 4 、经对筛选菌株的初步鉴定和发酵条件优化，确定了筛选菌株的种属并得到了其最优发酵条件。 关键词：生物丁醇；丙酮丁醇梭菌；丁醇发酵；条件优化 I 丁醇发酵菌种的筛选及鉴定 Abstract Objective: Based on the physiological and metabolic features of the bacteria producing butanol, an efficient and rapid screening method is established to screen the strains of high capacity of producing butanol from the soil and plant organs. Through m aking physiological and biochemical experiment、16S rDNA identification on the screening strains , preliminarily determin ing its taxonomy position.Through the nvestigat i ion of fermentation characteristics of the screening strains , optimizing its fermentation co