人端粒酶逆转录亚单位特异性siRNA对ES2细胞生长抑制作用的研究.pdfVIP

Information．Mar．2005．V01．19．No．3 哑基 医学信息2006年3月第19卷第3期Medical ·论著· 人端粒酶逆转录亚单位特异性siRNA对ES-2 细胞生长抑制作用的研究 沈志伟，李欣，刘民，汤华 (天津医科大学天津市生命科学中心实验室，天津300070) 摘要：目的 鼠的肿瘤形成实验，观察hTERT-siRNA对Es一2细胞体外及体内的生长抑制作用。结果 软琼脂克隆形成实验显示， 显慢于对照组。结论hTERT—SiRNA在体内外均可以有效、特异地抑制肿瘤细胞的生长。 关键词：端粒酶；hTERT；RNA干扰；RNAi；SiRNA；卵巢癌 端粒是真核细胞染色体DNA线性末端的特殊结构，它 1．2 对防止染色体端一端融合、重排、降解，维持其稳定有重要的 作用。大多数正常体细胞中，每次有丝分裂伴随约50～65bpcDNA序列(nln 的端粒DNA损失。当端粒减少到一临界长度时，其稳定染色 NA相应于其序列定位苷酸处，共23个碱 体的功能受损，细胞衰老凋亡{11。端粒酶是一种特殊的逆转录 AAGUUGCAAAGCAUUGGA 酶，它可以利用自身的RNA模板合成端粒的重复序列，抑制 为：sense链5-AGC UCCAAUGCUUUGCAA 分裂过程中端粒的缩短，维持染色体的稳定。成人的大多数 AUTT．3’，antisense链5’一AU 正常体细胞中几乎不能检测到端粒酶的活性，仅在造血干细 CUUGCU 胞、生殖细胞中有较低水平的表达。而大多数肿瘤细胞中端 粒酶活性异常增高，这是其跨越死亡危象获得永生性的重要 机制之一。端粒酶的这种特点使其成为肿瘤治疗的一个很有 5-GACUACACAAAUCAGCGAUUUTT一3’： anti． UCGCUGTuuUGUGUTGuC 价值的靶位点。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是一sense链为：5’．AAA 种转录后基因静默机制，已广泛应用于原虫、植物、哺乳动物 TT．3’。它们分别由美国GIBCO和中国奥科公司化学合成， 细胞基因功能的研究刚。现已发现通过导入序列特异的小双 经PAGE纯化并退火形成双链。 链干扰RNA(siRNA)可以诱导真核细胞内与其同源的mR．1．3细胞转染 采用脂质体转染法。实验分为3组进行： NA的特异性降解，从而达到沉默特定基因表达的作用网。 本研究中利用RNA干扰技术特异性沉默人端粒酶结构 中主要的功能部分——人端粒酶逆转录酶(humantelom— ③c组转染作为对照的空脂质体。转染前一天，以1×106 erasereverse transcriptase)的表达，探索了其对人卵巢癌细 胞系ES一2细胞的体外细胞生长和体内肿瘤形成能力的抑制 80％时，以每毫升无血清培养基含18．5ug 作用。 染后4小时，再添加0．5倍前面体积的新鲜含10％胎牛血清 1材料与方法 的全培养基，转染之后24小时全部更换为新鲜的含10％胎 1．1 细胞培养人卵巢癌细胞系ES．2来自本实验室的保 牛血清的全培养基。 1．4软琼脂克隆形成实验A、B、C三组细胞转染之后48 存株，细胞用含10％胎牛血清(天津血研所)，lOOug／ml链霉 素，100U／ml青霉素的RPMIl640(Gmco)培养液培养于小时，收集ES一2细胞并用2x 37。C、5％C02孵箱中。 细胞悬液。下层胶制备：在6孔板中铺0．5％的下层琼脂糖凝