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人脐血间质干细胞一般特性及其多向分化潜能 　　作者：王晶 ， 李志忠 ， 徐 茅 ， 迟作华 作者单位：暨南大学附属第一医院骨科， 广东 广州 510630 　　【摘要】 【目的】 观察人脐血间质干细胞增殖能力、细胞表面分子标志及多向分化潜能。【方法】 从人脐血中分离出单个核贴壁细胞并进行体外培养。将细胞以单克隆抗体标记后用流式细胞仪进行检测。向培养细胞中加入成骨、成软骨和成脂肪诱导剂，检测其多向分化能力。【结果】 脐血间质干细胞原代培养时间为7周。流式细胞分析显示这些细胞CD29、CD13、CD44等表达为阳性，但是它们不表达造血干细胞表面标志物。加入成骨诱导剂会导致细胞碱性磷酸酶的表达。采用微球培养法并加入软骨诱导剂对细胞进行诱导，用阿尔新蓝染色显示有蛋白多糖表达。在加入成脂诱导剂后，会导致细胞形态学改变，且油红O 染色为阳性。【结论】 通过体外传代培养的方法可以从人脐血单个核贴壁细胞中得到纯化的间质干细胞，脐血有望成为间质干细胞的替代来源。 　　【关键词】 脐血; 间质干细胞; 分化 　　脐血中富含造血干细胞已为人们所熟知，且脐血造血干细胞移植在临床上应用已有超过10年时间[1]，并已成为继骨髓之后造血干细胞移植的又一重要来源。而对于脐血中是否含有间质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)这一问题上，学者们却一直存在分歧。Erices等[2]的实验发现，从脐血分离的贴壁细胞表达间质干细胞相关抗原。而Mareschi等[3]研究却显示，从骨髓中容易分离出间质干细胞，而脐血中却不能。而且还有研究发现脐血中非造血干细胞表达内皮细胞[4]或树突状细胞的表面分子[5]。由此可见，对于脐血中非造血干细胞的定性方面，学术界仍无最终定论。本实验拟从脐血中分离并培养间质干细胞，对其一般生物学特性进行研究，同时对其进行成骨、成软骨以及成脂肪等诱导，观察其多向分化的潜能。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要试剂和仪器 　　流式细胞仪(Coulter-Elite)，荧光标记小鼠抗人抗体：CD13-PE 、CD106-PE、 CD14-PE、CD45-PECY5、CD34-FITC、CD29-FITC、CD44-FITC、CD54-FITC、CD49f-FITC、HLA-DR-FITC(BD Pharmingen)，TGF-Β1(PEPRO THCH)。 　　1.2 脐血间质干细胞的分离与培养 　　1.2.1 羟乙基淀粉沉淀法分离脐血间质干细胞 无菌条件下采集孕33～41周顺产或剖宫产胎儿脐血50～80 mL，肝素抗凝。孕妇无传染性疾病，胎儿无畸形，并征得家属及孕妇同意。将脐血与6%的羟乙基淀粉4 ∶ 1 比例混匀，室温静置60 min，待红细胞与血清分界清楚，吸取上清以400 × g 离心5 min，弃上清，有核细胞沉淀于管底，PBS 洗涤2 次。 　　1.2.2 脐血间质干细胞的原代及传代培养 将DMEM/F12+10%胎牛血清加入离心管中，吹打制成单细胞悬液。以5 × 106/cm2 密度接种于T25 培养瓶中，置于37 ℃、饱和湿度，体积分数为5%CO2孵箱中培养。5 d首次全量换液，去掉未贴壁的悬浮细胞。以后每周换液1次，待细胞长到80%汇合时，按照1 ∶ 2 的比例传代。传代后每周换液2次，细胞汇合达80%时继续按1 ∶ 2比例传代培养。 　　1.3 细胞表面标记物检测 　　将第3代细胞以0.25%胰酶消化后，PBS 洗涤3 次，制成1 × 106/mL 的细胞悬液。将待检细胞样品分为每管0.1 mL，阴性对照管加入鼠IgG-FITC、 IgG-PE 或IgG -PECY5，其它管分别加入鼠抗人CD13-FITC、CD106-FITC、CD14-FITC、CD45-PECY5、HLA-DR-FITC、CD34-FITC、CD29-FITC、CD44-FITC、CD54-FITC、CD49f-FITC 各20 ΜL，室温孵育30 min，流式细胞仪计数5 000～10 000个细胞，仪器自带软件分析。 　　1.4 细胞周期测定 　　取第3代细胞，用0.25%胰酶室温消化，PBS洗涤3次，弃上清。向离心管中加入1 mL预冷的70%的酒精，充分吹打制成单细胞悬液，细胞浓度约为1 × 106/mL。于4 ℃冰箱中固定24 h 后，离心，去上清，沉淀物重悬在1 mL碘化丙啶染液中(含RNase A 10 Μg/mL，碘化丙啶50 Μg/mL)，4 ℃孵育20 min。上流式细胞仪检测分析细胞周期。 　　1.5 脐血间质干细胞向成骨细胞诱导 　　成骨细胞诱导培养基：DMEM/F12，10%FBS，1