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低温保护剂对4℃保存猪精液的活率影响 孙时军，朱华鸿 2，陈晓峰3，俞颂东，李俊婷1，罗松1*，冯梦3 1.浙江省宁波市鄞州区畜牧兽医站，浙江宁波，315100；2.浙江省宁波市鄞州区咸祥镇畜牧兽医站，浙江宁波，315141；3.浙江宁波福宁种猪有限公司，浙江宁波，315141； 摘要：本实验采用1%浓度的甘油、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲亚砜作为精液低温保护剂，通过精子降温-冷藏-复苏三个重要步骤，观察第七天保护剂对精子活率的影响。结果表明：在4℃下，乙二醇对精子活率保护作用最好，第7天仍能达到0.6以上，其次是甘油、二甲基乙酰胺和二甲亚砜组，空白对照组活率最低，低于0.2。 关键字：低温保护剂；猪精液；精子活率；复苏 家畜精液保存技术是二十世纪随着人工授精技术广泛应用而产生的，原理是通过降低或抑制精子新陈代谢程度达到延长精子在体外寿命的目的。为此，研究者试验将精液放在低温状态(非结冰)或冷冻(结冰)状态下保存。精液低温保存通常是在0～5℃范围施行，这是在冷冻保存以前常用的方法。据报道，在脱脂乳中加甘油10％～13％用于稀释牛精液，在低温下可保存14天仍具有很高的受精能力；在含有咖啡因6～10mg的脱离子缓冲溶液中保存牛精子，在6～7℃时，最长能维持生存时间达519小时。低温保存精液的局限性仍很大，当冷冻保存技术成熟以后，已很少再使用和研究，另一方面，与牛精液相比，猪精液对低温更敏感，因此，至今仍没有成熟稳定的低温保存猪精液的方法。 理论上来说，低温下精子代谢活动水平更低，保存时间比常温下长的多。同时可应用普通冰箱保存，生产运输成本和操作技术与常温精液基本相同，对于多数人工授精站无需增加设备及专业人员，则可较大副度地提升优良种畜利用度，扩展供精范围， 序号 冷冻保护剂 添加量（ul） 稀释精液（ml） 保护剂浓度 1 甘油 200 20 1% 2 乙二醇 200 20 1% 3 二甲基乙酰胺 200 20 1% 4 二甲亚砜 200 20 1% 5 空白对照组 0 20 0% 休眠和复苏程序 预置隔热效果好的泡沫箱，加入35℃的温水适量，将装瓶精液放入泡沫箱中，并固定好，盖好泡沫盖，并用厚毛巾包裹好泡沫箱，放入4℃冰箱。以后每天两次，在冰箱中轻轻摇晃精液瓶，以防精子沉淀死亡。第七天，观察精子前，将精液瓶放入35℃恒温水浴锅中，静置30分钟。 数据统计 采用完全随机设计，使用Excel（2003）处理数据，用SPSS (1.0)统计软件对数据进行单因子方差分析及LSD法多重比较，所有数据均以平均数±标准误表示。肩注字母相同小写字母表示两者差异不显著(P0.05)；不同小写字母表示差异显著(P0.05) 讨论 3.1 猪精液低温保存的可行性 由于猪精子对低温较马和牛等其他家畜更为敏感，耐受能力差，容易发生冷休克等特点，使得猪精液低温保存技术的研究进展较为缓慢。De Ieuw提出，随着温度的降低，精子质膜的磷脂由液相胶相，使膜的通透性，导致精内部的阳离子和酶外，及膜控制酶活性和扩散能力的降低，精子的获能、顶体反应及死亡。Ahhouse等研究，低于，精子的存活时间和活率均急剧下降。Funahashia等在1℃条件下稀释保存猪精液天后，精子仍具有较高的活率和体外穿透卵子的能力提示猪稀释精液保存的温度界限可以降低DE LEEUW F E，COLENBRANDER B，VERKLEIJ A J．The role membrane damage plays in cold shock and freezing injury[J]．Reprod Domest Anim，1990，27(1)：95-104. ALTHOUSE G C，WILSON M E，KUSTER C，et a1．Characterization of lower temperature storage limitations of fresh extended porcine semen [J].Theriogenology，1998，50(4)：535-543． 3. FUNAHASHIA H，SANO T．Select antioxidants improve the function of extended boar semen stored at 10℃[J]．Theriogenology，2005，63：1605-1616． 4. 徐振军，任康，白桂芬等.带精浆直接稀释法探讨猪精液低温保存的可行性[J].广西农业生物科学，2006,25:24-27. 5. 龙翔，邰秀林.不同冷冻保护剂在猪精液冷冻中的作用分析[J]。畜禽业， 1999 ,09:16-19. 6. 李兆华，钱芙蓉，朴昌植等，不同稀释液对猪精液4℃保存效果的影响研究[J].安徽农业科学，