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实验一 培养基的制备和灭菌 实验目的 (一)熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。 (二)掌握培养基和无菌水的制备方法。 (三)掌握高压蒸汽灭菌技术。 基本原理 培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质用人工方法配制而成的基质。其中含有水分、碳水化合物、含氮化合物、无机盐及各种必要的维生素。培养基可以为微生物的生长提供能源、组成菌体细胞的原料以及调节代谢活动。由于不同微生物营养类型不同，对营养物质的要求也各不相同，因此，需要配制不同种类的培养基。一般培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，培养放线菌常用淀粉培养基，培养霉菌常用马铃薯培养基，培养酵母菌常用麦芽汁培养基（或麦芽糖、蛋白胨培养基）。培养基除了要满足微生物生长所要求的各种营养物质外，还应保证微生物所需要的其他生活条件，如适宜的酸碱度，渗透压等，因此，根据不同种类微生物的要求，应将培养基调节到一定的 pH范围，如，细菌培养基中性偏碱、放线菌培养基偏碱、霉菌、酵母菌培养基偏酸。 根据研究的不同，可以将培养基制成固体、半固体和液体三种形式，固体培养基的成分与液体相同，仅在液体培养基中加入凝固剂作支持物，通常加入0.5~2.0 %的琼脂，半固体加入0.3~0.5 %琼脂作支持物，有时也可用明胶或硅胶作为凝固剂。 培养基的种类很多，它们的配方及配制方法虽各有差异，但一般培养基的配制程序却大致相同。例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。 高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧地将锅内冷空气从排气阀中驱尽，关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 实验器材 (一)药品：待配各种培养基的组成成分（牛肉膏、蛋白胨、NaCl）、琼脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。 (二)设备：高压蒸汽灭菌锅、烘箱、冰箱、电炉等。 (三)仪器及玻璃器皿：天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、玻璃棒、试管、烧杯、瓷缸、量筒、三角瓶、培养皿、玻璃漏斗等。 (四)其他物品：药匙、铁架台、漏斗架、止水夹、称量纸、pH试纸、记号笔、标签纸、纱布、棉花、牛皮纸、线绳、剪刀、镊子、白瓷盘等。 实验步骤 (一)玻璃器皿的洗涤和包装 1.玻璃器皿的洗涤 玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中，用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。 2.灭菌前玻璃器皿的包装 (1)培养皿的包扎：培养皿由一盖一底组成一套，可用报纸或牛皮纸将几套培养皿包成一包。 (2)移液管的包扎：在移液管的上端用细铁丝塞入一小段棉花，塞入此小段棉花应距管口约0.5cm左右，棉花自身长度约1~1.5cm。棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。 实验图-3 移液管的包扎 先将报纸裁成宽约5cm左右的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条报纸的一端，约成45℃角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，有手将移液管压紧。在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。 (二)液体及固体培养基的配制过程 1.液体培养基配制 (1)称量：一般可用0.01g天平称量配制培养基所需的各种药品，先按培养基 配方计算出各成分的用量．然后进行准确称量。 (2)溶解：将称好的药品置于一烧杯中，先加入少量水(根据实验需要可用自 来水或蒸馏水)，用玻璃棒搅动，加热溶解。 (3)定容：待全部药品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需体积。如某种药品 用量太少时，可预先配成较浓溶液，然后按比例吸取一定体积溶液，加入至培养基中。 (4)调pH：一般用pH试纸测定培养基的pH。如培养基偏酸或偏碱时，可用 1mol/L NaoH或1mol/L HCl溶液进行调节。调节pH时，应逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。边加边搅拌，并不时用pH试纸测试，直至达到所需pH为止。 (5)过滤：用滤纸或多层纱布过滤培养基。一般无特殊要求时，此步可省去。 2.固体培养基的配制 配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基加热煮沸，再将称好的琼脂(1.5~2％)加入，并用玻璃棒不断搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化，最后补足因蒸发而失去水分。 (三)棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎 为了培养好气性微生物，需提供优良通气条件，同时为防止杂菌污染，则必须对通入试管或三角瓶内空气预先进