cDNA文库构建的注意事项.pdfVIP

中国试剂网 3.20.1.1 cDNA 文库构建的注意事项 构建全长 cDNA 文库分为噬菌体文库和质粒文库，二者大同小异。无论怎样， 应当注意如下几个方面： 一、保证获得数量足够的高质量的起始RNA 。构建cDNA 文库要求的RNA 量比 做RACE 和Northern blot 的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用 纯化总mRNA 后进行反转录，这比直接采用总RNA 进行反转录而构建的cDNA 文库好，虽然后者也并不是不能做。老版本CLONTECH 的SMART 4 的中级柱 子要求纯化后的总mRNA 量最好在0.05-0.5 微克左右，这就要求起始总RNA 量 较多。虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA 也可以构建cDNA 文库， 但这是针对材料极为稀缺者而言，但起始RNA 太少还是会或多或少影响文库构 建成功的风险和文库的代表性。至于RNA 的质量，如果采用纯化总mRNA 后反 转录，则对总RNA 的杂质方面要求稍松，但对RNA 的完整性则一丝不苟，要 求未降解。如果直接采用总RNA 进行反转录，则对总RNA 的质量要求非常高， 不仅要求RNA 相当完整而无降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰酸 胍等杂质少，最好是试剂盒抽提的。 二、反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键。这是构建 cDNA 文库中最 贵的一步，也是核酸质变的一步，它将易降解的RNA 变成了不易降解的cDNA 。 反转录不成功，说明一次文库方案的夭折。反转录效率不高表现在一是部分 mRNA 被反转录了，但还有相当一部分本该反转录的mRNA 未被反转；二是只 有少部分mRNA 被反转录通了即达到帽子结构最近处，而很大一部分mRNA 没 有反转录完全，总的全长 cDNA 太少，这就难以构建好的全长 cDNA 文库。少 量程度的mRNA 降解或反转录不完全在SMART 4 等试剂盒及手工方法构建中对 文库的滴度影响不大，但对文库的全长性则有很大影响。Invitrogen 公司基于去 磷酸化、去帽、RNA 接头连接后再反转录的新技术（可参考其 GeneRacer 说明 书）从原理上是保证最终获得全长cDNA 的最好方法，但对mRNA 的完整性要 求非常高，理论上讲必须是带有帽子结构和Poly A 结构的全长mRNA 且反转录 完全，才能进入文库中。反转录完成后点样检测 cDNA 的浓度及分子量分布是 很重要的。 三、反转录后至包装到噬菌体外壳蛋白之前的诸多步骤的操作相对容易，但其中 中国试剂网 3.20.1.1 的层析柱cDNA 分级很关键。这一步稍不注意会影响成功性或影响获得的cDNA 的片段分布特点。这一步的操作要小心，尤其要在加入 cDNA 之前通过反复悬 浮和试滴保证柱子能正常工作，cDNA 的加入和收集要精力集中。获得的每一级 的 cDNA 量很少，检测时带型很暗，所以要用新鲜做的透明薄胶检测，根据检 测结果一定要舍弃太短的cDNA （一般400bp 以下就不要了，因为短片段太多会 严重影响后面的连接转化效果及文库质量）。 四、噬菌体文库或质粒文库均对载体与 cDNA 的连接效率要求很高，也对连接 产物转染或转化大肠杆菌的效率要求很高。连接效率高低直接关系到文库构建是 否成功，更要注意的是文库连接与一般的片段克隆的连接不一样。一般的片段克 隆连接是固定长度的载体与固定长度的目的DNA 连接，而文库连接是固定长度 的载体与非固定长度的目的DNA 连接，目的基因cDNA 长的有 10kb 以上，短 的只有500bp 或更短。一系列长度不等的 cDNA 与载体在一起连接的结果，不 同长度 cDNA 的连接效率就不一样。有的专家的经验是，根据分级结果，有意 识地将长度不同的 cDNA 群分别与载体连接，再分别转化或转染大肠杆菌，分 别完成滴度检测，最后将不同长度级别的文库混合在一起供杂交筛选。