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PCR引物设计方法 第三小组成员:黎娜、李毛毛、李天胜、梁喜俊、林海帆、刘侃、罗静、门吉帅 Oligo软件介绍 Oligo是一种多功能的程序，通过从一个序列中有哪些信誉好的足球投注网站、选择寡核苷酸而广泛运用于PCR、DNA测序、定向诱变及各种杂交中。它采用nearest neighbor thermodynamic values的方法计算出杂交的温度及寡核苷酸的二级结构。 Oligo软件已经被认可作为一种选择及分析寡核苷酸的工业软件，运用于各种分子生物学中。最早的商业化的软件在1989年被开发出来。 PCR引物设计技巧 ①引物的长度一般为15-30 bp，最好在18~24 bp，因为太短易形成错配(False priming) 降低特异性，而太长也会降低特异性，并且降低产量 。 ②引物在模板内最好具有单一性，也就是说在模板内部没有错配。特别是3’端，一定要避免连续4个以上的碱基互补错配。 ③引物序列的GC 含量最好在40％一60％，且上下游引物序列GC含量的差异不要太大，3’端最后5个碱基最好不要富含GC，特别是连续3个的G或C。 ④DNA双链形成所需的自由能AG，应该以5’端向 3’端递减，3’端AG最好不要高于9．0 keaf/mol ⑤避免形成稳定的引物二聚体(Dimer and Cross DimeO 和发夹结构(Hairpin)，AG高于4．5 keal／mol时易引发 上述两种结构的产生。 ⑥ 引物所在的模板区域应该位于外显子区，最好跨越一个内含子区，这样便于对扩增出来的片段进行功能鉴定和表型分析。 ⑦ 如果以DNA为模板设计引物，产物长度在100—600 bp比较理想。而以mRNA为模板设计引物时，产物长度在150—300 bp比较理想。 ⑧5’ 端对PCR影响不太大，可以引进修饰位点和标记物 。 Sus scrofa?insulin-like growth factor 2 (somatomedin A) (IGF2), mRNA 按照bgiii的酶切位点检验可信度 Forward primer的参数 （点击 edit） reverse primer的参数 Forward primer 特异性检验false priming sites Reverse primer 特异性检验 Composition Tm 二：引物5端添加酶切位点 即在设计引物后在5端人工添加一个酶切位点 设置筛选参数