制备HPLC技术(49页).ppt

制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。 制备HPLC概述—制备HPLC与 分析HPLＣ比较 　　 色谱柱的柱容量（柱负荷） 对分析柱：不影响柱效时的最大进样量； 对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量； 超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。 超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。 上样量的调整：mp/ma=lp/la * r2p/r2aL:柱长；m：进样量；r：色谱柱内径 p: 制备柱；a：分析柱  制备HPLC技术问题—条件的优化 1）制备的目的是在一次操作中尽可能地多上样，所以，首先得在分析柱上实现超载，否则，分析柱分离得再漂亮，再在制备柱中线性放大时就因为成本不合理而被无情地否决。 2）制备的目的是分离你所关心的组分，只要它能与其它杂质分离的好就行了，所以不要希望在分析柱上先得到所有组分的基线分离，完全没有必要！设计梯度时只需对目的物前后5-10%梯度的范围进行精细分离。  制备HPLC技术问题—条件的优化 3）制备中常常因为超载而无法使目的物与邻近杂质间达到基线分离，可以采用分段收集的方法得到指定纯度的目的物，要求越纯，单次操作的得率也越低。 4）制备中因为目的物来之不易，常常需要将纯度不合格得目的物重新上柱循环，一般只需稀释1-2倍就可以了。由于重新上柱是会增加成本的，所以超载的量要平衡单次操作的纯品得量和效益与返工成本，以单位纯品数量进行成本核算，以优化最佳上样量。  制备HPLC技术问题—问题解答 同一种填料的分析柱、制备柱按线形放大公式套，分离度会不会变化？ 一般会有一定的变化，原因有以下几点 （1）制备柱的装填是否均匀，如不均匀则可能产生涡流扩散使各个组分的经过通道的直径不同、阻力不一样，停留时间不同，色谱峰可能变宽。 （2）如果样品在流动相中溶解度小，在制备色谱上会有不同的峰展宽。 （3）如果样品在分析柱上有展宽或拖尾的现象，放大到制备柱上后峰的展宽和拖尾经常会非常严重，导致分离失败。  制备HPLC技术问题—流速问题 一根大柱子（c-18，高压柱)，可使用流速在150ml/min左右，但系统只能提供20ml/min的流速，如果使用这套系统进行纯化，效果会如何呢？这样会不会使样品扩散？使分离效果下降？ 对分离不会有什么问题的，一般来讲，制备柱的填料大于分析型色谱填料，内扩散阻力也相应地大很多。流速越低越有利于分离度的改善，样品浓度也会相应提高。唯一的坏处是：分离时间会很长 ？  制备HPLC技术问题—流速问题  制备HPLC技术问题—组分保留时间的估计 用分析柱子在同等色谱条件下（同样的固定相和流动相）测定保留时间后，按照单一组分的线流速（不是体积流速）一定，通过计算可以知道组分的大致保留时间区域。  制备HPLC技术问题—梯度 gradient elution can be applied on prep system.two prep system:??1. Luna 20x50mm RP C18 5um column, MS as detector, gradient: 5%ACN + 95%H2O to 95%ACN + 5%H2O in 9mins, flow rate 40ml/min??2. Luna 20x150mm PR C18 5um column, UV detector, gradiatet: same as above, but total rum time 18mins, flow rate 20ml/minboth systems can give good separation.  制备HPLC技术问题—梯度 　　分离效果取决于梯度的选择，理论上梯度越小，分辨率越高。在分析上摸好条件，上制备柱往往还要降低一些洗脱液的浓度。  制备HPLC技术问题—流动相 流动相中磷酸盐的去除： 样品浓缩后全部进样吸附，用水冲去盐后，再用甲醇或其他适当溶剂将目标物冲下，即可 只要样品在水洗脱时有一定的保留（反相填料柱），可以一直加样至最大负荷（检测到样品流出） 用G25脱盐 可以采用离子吸附的办法去掉（可以参考离子吸附有关技术）。  制备HPLC技术问题—柱子再生 柱子再生处理办法如下： （1）依次用水，甲醇，四氢呋喃，氯仿，甲醇来冲洗柱子，每种溶剂5-10个柱体积。 （2）如果效果不明显，将柱