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基因组文库和cDNA文库的构建及筛选,基因组文库和cdna文库,cdna文库筛选,cdna文库构建,cdna文库的构建过程,cdna文库构建试剂盒,如何构建cdna文库,基因组文库构建,基因组文库的构建,基因组文库构建方法
中国试剂网 3.20.1.11
基因组文库和cDNA 文库的构建及筛选
刘芝华 中国医学科学院肿瘤研究所 分子肿瘤学国家重点实验室
概念:
基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA 克隆群体;cDNA
文库是指含有所有重组cDNA 的克隆群体。
基因组文库:来源于基因组 DNA ,反映基因组的全部信息,用于基因组物理图
谱的构建,基因组序列分析,基因在染色体上的定位,基因组中基因的结构和组
织形式等。
cDNA 文库:来源于细胞表达出的 RNA ,反映基因组表达的基因序列信息,用
于研究特定细胞中基因的表达状态和表达基因的功能等。
基因文库=基因组文库+cDNA 文库
载体的种类和特征:
受体细胞 结构 插入片段 举例
质粒 E.coli 环状 很小,8kb pUC18/19 ,T-载体,
pGEM3z
λ噬菌体 E.coli 线状 9-24kb EMBL ,λgt 系列
丝状噬菌体及E.coli 环状 10kb M13 系列
噬菌粒
粘粒载体 E.coli 环状 35-45kb
BAC E.coli 环状 约300kb
PAC E.coli 环状 100-800kb PCYPAC
YAC 酵母细胞 线性染色体 100-2000kb
MAC 哺乳动物细胞 环状 1000kb
病毒载体 动物细胞 环状 SV40 载体,昆虫杆状
病毒载体
穿梭载体 动物细胞和细环状 pSVK3 质粒,PBV,Ti
中国试剂网 3.20.1.11
菌 质粒,
· DNA 的制备:高分子量的外源DNA 100-150kb
· 剪切:随机切割
· 载体:
l 噬菌体:48.5kb, 插入型(最多可容纳 9kb) 、取代型(可容纳 38-51kb ,最适
19-20kb), EMBL, Charon 粘性质粒(Cosmid) :4-6kb, 质粒+噬菌体的性质,可容
纳大片段的外源基因,最多可容纳46kb 。
酵母人工染色体克隆体系(YAC ,Yeast Artificial Chromosome Cloning System )
插入大小200—1000kb
· 载体DNA 的制备:
载体DNA 酶切反应载体臂的纯化载体脱磷处理 (常用BamHI ) (蔗
糖密度梯度离心) (碱性磷酸酶)
· 连接和包装:外源片段与两臂之间的比例,包装蛋白
· 感染宿主菌:选择合适的宿主菌,LE392, NM538, NM539, KW251 等
· 基因组文库的保存和扩增:完整性和代表性
测滴度,要在106fu 以上; 保存,氯仿4 ℃,7% DMSO -70℃
cDNA 文库的构建
· 分类:按表达类型分:表达型、非表达型
按载体类型分:质粒cDNA 文库、噬菌体cDNA 文库
· 关键:mRNA 的获得。完整、种类多、不能降解。电泳应在0.5-8kb 之间。已
知探针做Northern 或PCR 。
· 反转录:AMV 鸟成髓细胞性白血病病
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