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中国试剂网 3.13.11.17
大肠杆菌感受态的制备及重组 DNA 的转化
1.感受态的制备
(1)接种单菌落于2ml LB 培养液中, 37 ℃过夜。
(2 )取0.25ml 过夜菌入 25ml LB 培养液中,37℃振摇4~6h 至 A590=0.4~
0.6 。
(3 )倒入50ml 管内,水浴 10min,以2500~3000rpm 离心 5min,弃上清。
(4 )缓慢加入75mmol/L 预冷 CaCl25ml 悬浮菌体,冰浴 20min ,同上离心
弃上清。
(5 )缓慢加入 75mmol/L 预冷 CaCl21.0ml 轻轻混匀后分装在 1.5ml Eppendorf
管中,每管 200 μl,冰浴 1~2h 。
2 .重组DNA 的转化
(1)将3 只 Eppendorf 管按下列转化项目作好标记:
(2 )冰浴30min 至 1h。中间摇动3 次,以防受体菌沉底。
(3 )42 ℃90s 。
(4 )37℃水浴 5min 。
(5 )加入无相应抗生素的Lb 200 μl,混匀后,37℃水浴 30~60min 。
(6 )分别取3 组反应物各 50 μl 在含相应抗生素的固体 LB 培养基平皿上涂
布,室温下干燥,然后倒置于 37℃温箱中培养过夜。
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