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中国试剂网 3.9.109 常规杂交反应存在的问题 常规杂交反应由于受到探针解链温度、溶液中靶序列的初始浓度及探针长度 的影响。样品中不同探针所对应的靶序列的拷贝数不尽相同，探针的解链温度也 难以保持一致，这样不同位点的杂交速度并不完全与各自靶序列的拷贝数成正 比，检测结果也就不具有良好的平行性。所以必需选择最理想的条件以尽可能使 正确配对的序列不被遗漏，并使杂交错配降到最低。DNA 双链进行杂交配对时， A:T 间形成2 个氢键而G:C 间形成3 个氢键，所以同样长度的探针由于G+C 含 量的差异而具有不同的解链温度，这样杂交的动力学就会有差别。以TMAC 作 为溶剂可以平衡AT 与GC 的杂交结合能，因而可在一个杂交条件下获得比较理 想的杂交效果[1,2]。例如，Honore 等人将PCR 扩增得到的探针与尼龙膜固定后 在 3M 的TMAC 溶液中与标记的高度简并的寡聚核苷酸进行杂交反应。在这种 条件下，Tm 将与G+C 含量无关而只决定于探针的长度。而且发现，掺入脱氧次 黄苷(deoxyinosine, I)的寡核苷酸探针在比Tm 值低10℃的条件下可以进行良好的 杂交[3]。Oh 等用15nt 长的探针以SSOP(sequence-specific oligonucleotide probe， 序列特异的寡核苷酸探针)方法同一温度下在TMAC 溶液中对HLA-A 进行杂交 分型，一次性可以检测到30 个通过等电聚焦技术鉴定的类型[4]。杂交后的DNA 芯片在严谨条件下洗涤以去除未杂交的残留核酸样品。但这种常规杂交方式在速 度、灵敏度和特异性等方面都阻碍了整个芯片的杂交效果。因为，探针必需具有 相似的解链温度，这样才能保证杂交条件的一致性。杂交反应与溶液中靶序列的 初始浓度成正比，所以必需提高靶DNA 的浓度以加快反应速度。 [参考文献] 1. Bains W. Selection of oligonucleotide probes and experimental conditions for mµltiplex hybridization experiments. Genet Anal Tech Appl, 1994;11(3):49-62. 2. Honore B, Madsen P. The tetramethylammonium chloride (TMAC) method for screening cDNA libraries with highly degenerate ol gonucleotide probes obtained by reverse translation of amino acid sequences. Methods Mol Biol, 1997;69:139-46. 3. Honore B, Madsen P, Leffers H. The tetramethylammonium chloride method for screening of cDNA libraries using highly degenerate oligonucleotides obtained by backtranslation of amino-acid sequences. J Biochem Biophys Methods,1993; 27(1):39-48. 中国试剂网 3.9.109 4. Oh SH, Fleischhauer K, Yang SY. Isoelectric focusing subtypes of HLA-A can be defined by oligonucleotid