真核基因组DNA的克隆 策略和方法.docVIP

真核基因组DNA的克隆cDNA的克隆化技术的成熟，很多染色体的mRNA互补的序列已弄清楚，为丰富人体遗传信息库做出了贡献。除此以外，真核细胞染色体DNA消化后的片段，合适的载体进行克隆，也是得到目的基因的重要方法。染色体DNA序列大部分含有插入序列，即内含子（intron)．内含子的数量不等。而cDNA则仅代表了外显子(exon）的序列。大肠杆菌等原核细胞不能识别真核细胞染色体DNA的内含子，因此其表达研究，仅可应用cDNA，而不能应用真核基因组带有内含子的DNA基因治疗中的目的基因，既可选择DNA，也可选择染色体DNA。一、染色体DNA克隆的载体构建染色体DNA文库并进行克隆的载体有两大类：入噬菌体载体和粘粒载体。质粒载体其容量有限，而染色体DNA由于带有内含子序列而较长；单链丝状噬菌体载体仅用于克隆单链DNA,因此质粒载体和单链丝状噬菌体载体都不适用干染色体DNA的克隆。由于粘粒可接纳近45kb的外源DNA，几乎是入噬菌体载体载量的2倍，因此，在一个哺乳动物基因组DNA文库中，仅需350000个重组粒，则可望某一特定的单拷贝序列存在于其中的概率达99％。然而，在粘粒中构建和贮存文库要比在入噬菌体中更困难得多，因而只有当靶基因过大，而不能为单个入噬菌体所包容，或者要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克隆时，才采用粘粒。染色体DNA克隆最为常用的载体还是入噬菌体载体。以入噬菌体为基础构建的载体尽管已是分离众多真核cDNA及基因组DNA的有力工具，但它们也只能接纳大小在一定范围内的插入片段。许多基因由于过于庞大，而不能作为单一片段克隆于这些载体之中，如人凝血因子讯基因长达180kb，肌营养不良基因至少长1800kb，因此需要建立容量更大的克隆载体。酵母人工染色体（YAC）方法的建立，使克隆DNA大区段的工作至少有了可循之经。使用YAC载体进行克隆时，基因组DNA须在剪切力较小的条件下从实验组织中小心制备，以便得到平均数百万碱基对大小的片段。随后应用一限制酶（如EcoRD部分消化DNA，以产生平均大小为20一500kb的大片段‘这些片段再连接到经过适当处理以防止自身环化的YAC载体两臂上。除EooRI以外，也可用Notl和Mlul一类切点稀少的限制酶进行完全消化。二、从哺乳动物细胞中分离高分子量DNA哺乳功物DNA的分离通常是在有EDTA和SDS一类的去污剂存在！、一l!l蛋白酶K，消化细胞，随后用酚抽提而实现的。低分子量的杂质以透析法加以去除。这一方法获得的DNA，其大小为100一150kb．适用于以入噬菌体载体构建基因组DNA文库。然而，若要用粘粒建立基因组DNA文库，则要求用更大的DNA。三、染色体DNA文库的建立不论DNA的碱基组成及序列，而以真正随机的方式将DNA打断成片段的唯一方法就是机械剪切。但由此方法制备的染色体DN段的末端，并非用于克隆的粘性末端，需要进一步处理。包括末端的修复、甲基化、与接头连接并以合适的内切酶进行消化以便产生合适的粘性末端。经过机械剪切或限制性内切酶的消化，产生的片段长度也不一致，必须通过密度梯度离心纯化，才能得到所需的大小的片段。按照DNA克隆化中程序的方法，将入噬菌体载体用合适的限制性内切酶消化，然后再与处理过的染色体DNA在T4DNA连接酶的作用下进行连接，进行大规模地包装反应，并建立预期大·小的基因组DNA文库。基因组DNA文库建立以后，还必须对此文库进行扩增。四、染色体DNA文库的筛选一’染色体DNA文库的筛选主要是应用Southern杂交分析方法等。1．将可疑阳性克隆，快速小量法提取DNA，以同位素或地高辛等标记的探针进行杂交，显影或显色分析。2．入噬菌体噬菌斑的原位杂交先将入噬菌体的噬菌斑在硝酸纤维素膜上或尼龙膜上进行固定，入噬菌体噬菌斑也可以原位进行扩增后再固定．然后对入噬菌体分离物进行快速分离快速分析．3.DNA序列分析克隆的DN段，最后以DNA序列分析，加以证实。快速克隆真核生物基因，目前都是通过功能基因组或是同源序列法。选用功能基因组的方法，需要构建好的cDNA文库，然后利用合适的探针进行筛选。如果你有构建好的差异表达的文库，就更方便了。通过这种方法可以获得大量的候选基因，但是后续的转基因验证工作，工作量相当大。如果选用同源序列法，只能克隆在其他物种中已经克隆的基因。将这些在其他物种中已经克隆，但在昆虫中未见报道的基因的序列找到，利用已知的昆虫基因组序列与之比较。利用两者的同源保守区段设计引物，将昆虫中的这一基因扩增出来。得到片断以后，再将整个基因拿到。目前基因克隆化中比较常用的载体一以及由这些载体改建和衍生的多种类型。可以根据各种载体的特点以及克隆基因的特点进行选择。根据载体和目的基因片段末端的性质，在质垃载体中进行