实验八　限制性内切酶酶切DNA及分析.pptVIP

* 实验八　限制性内切酶酶切DNA及分析 实验原理 　　1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA用作基因探针，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为“DNA指纹”。 DNA指纹具有下述特点： １.高度的特异性 ２.稳定的遗传性 ３.体细胞稳定性 DNA指纹图谱法的基本操作： DNA提取(及扩增）； DNA酶切及电泳：经酶切片段琼脂糖凝胶电泳后，按分子量大小分离 ； Southern转移：将琼脂糖凝胶上的DNA带转移至尼龙滤膜上 ； 杂交 ：将已标记的小卫星DNA探针与膜上具有互补碱基序列的DNA片段杂交 ； 放射自显影 ：Ｘ－光片洗片后即可得到杂交图谱（ DNA指纹）。 　　用牛的小卫星探针pBM6.4产生的黄牛DNA指纹图 　　用牛的小卫星探针pBM6.4产生的鸡DNA指纹图 　　人类DNA指纹。来自犯罪现场的血迹指纹*和7个嫌疑者的血液指纹，其中标本3和犯罪现场的血迹指纹相同。(引自Griffiths, 1999) 本次实验内容： 　　DNA样品提取→酶切反应→琼脂糖凝胶电泳→凝胶成像仪中观察 EcoRⅠ: 5＇ G↓AATTC 3＇ 3＇ CTTAA↑G 5＇ 5’protruding end PstⅠ: 5＇ C↓TGCAG 3＇ 3＇ GACGT↑C 5＇ 3’protruding end 操作步骤： １.DNA样品的制备：含样品序列的质粒DNA提取（CS,S1-S５)； ２. DNA样品的酶切反应 设置DNA样品的双酶切反应，按下列顺序加样（体积：μl）： 反应管 　　样品DNA 　10 双蒸水 4 酶液（buffer+EcoRⅠ+ PstⅠ) 6 总体积 20 　　加完反应液，温和混匀，置于37℃水浴中反应1.５小时，取出后瞬时离心，加4ul（含EB）上样缓冲液，混匀，所有样品加入上样孔。 ３.酶切产物的琼脂糖电泳 （１）琼脂糖凝胶制备（１％）：称0.2g琼脂糖粉，加入20ml 0.5XTBE电极缓冲液，水浴加热融化，冷却至50-60℃时倒入铸胶盘中，冷却后凝胶即形成。(注：现在所用胶模每块胶只需20ml即可)。 （２）取已制备好的酶切DNA样品，用移液器将样品小心地加入点样孔。每块凝胶预留一个点样孔，加入DNA分子量标记物。 （３）盖上电泳槽，打开电源并调节电压（通常用120伏），电泳40-60分钟。 ４.结果观察与分析 　　关闭电源，取出凝胶，在凝胶成像仪中观察DNA的迁移位置，并讨论实验结果。判断CS与哪一个DNA样品是同一个样品，找出罪犯。 *