2++蛋白质样品的初级分离.ppt

2 蛋白质样品的初级分离 第一节 蛋白质样品的选材与破碎 1 制备蛋白质的原材料的选择和处理 微生物：注意生长期 分泌到培养基中代谢产物、胞外酶 菌体含有的生化物质如胞内酶、核酸 植物： 去壳、脱脂、品种、季节、生长发育 动物： 含量丰富的脏器组织为原材料 对于处理的材料，若不立即进行试验，应冷冻保存。 对易分解的蛋白质应选用新鲜材料制备。 1.2 重组蛋白质的制备材料 重组蛋白可在E.coli、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等体系中得到高效表达，其表达形式一般可分为： （1）细胞外的分泌表达； （2）细胞内可溶性表达； （3）细胞内不溶性表达（包涵体） 1.3 制备蛋白质的原材料的预处理 为了纯化蛋白质，采用有效的方法进行组织细胞或培养细胞的破碎是提取胞内蛋白质的关键步骤。 1.3.1 细胞的破碎方法 1.3.1.1机械破碎法 1.3.1.1机械破碎法 1.3.1.1机械破碎法 1.3.1.1机械破碎法 1.3.1.1机械破碎法 机械法破碎细胞的缺陷 1.3.2.2非机械破碎法 1.3.1.2非机械破碎法 化学破碎法的特点 1.3.2.2非机械破碎法 1.3.1.2非机械破碎法 各种组织适用的细胞破碎方法 1.3.1.3选择破碎方法的依据 细胞的处理量 细胞的密度和细胞壁的强度 目标产物对破碎条件的敏感性以及产物在细胞中的位置 破碎程度 产物的稳定性 提取分离的难易 细胞破碎率的评价 细胞破碎率的计算方法 第二节 目标蛋白质的离心分离 2.1 离心技术的原理 将处于悬浮状态的细胞、细胞器、病毒和生物大分子等称为“颗粒”。每个颗粒都有一定大小、形状、密度和质量。当离心机转子高速旋转时这些颗粒在介质中发生沉降或漂浮，它的沉降速度与作用在颗粒上的力的大小和力的方向有关。 2.1.3 离心条件的确定 离心力 离心时间（与颗粒的沉降时间有关） 温度和pH值（防止欲分离物质的凝集、变性和失活） 2.3 离心分离技术的种类 差速离心法是指通过不断增加相对离心力，使沉降速度不同的颗粒，在不同离心速度及不同离心时间下分批离心方法。差速离心法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。主要用于分离细胞器和病毒。 ②密度梯度离心法 亦称平衡密度梯度离心法。密度梯度离心法包括速度区带和等密度离心二种方法。后者又可分为预制梯度等密度及自形成梯度等密度两种方法。 速度区带离心法 在离心前离心管内预先装入密度梯度介质(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等)，待分离的样品铺在梯度液的顶部或梯度层中间，同梯度液一起离心。由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带。沉降系数越大，往下沉降越快，所呈的区带也越低。沉降系数较小的颗粒，则在较上部分依次出现。 蔗糖密度梯度离心 等密度离心法 某些密度梯度介质经过离心后会自身形成梯度，如细胞分离液Percoll。待分离样品可和梯度介质先均匀混合，梯度介质由于离心力的作用逐渐形成管底部浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀的颗粒也发生重新分布。当管底介质的密度大于颗粒的密度时，颗粒上浮；当管顶介质的密度小于颗粒的密度时，则颗粒沉降；最后颗粒进入到一个它本身的密度位置，颗粒不再移动，形成稳定的区带。 2.4 超速离心 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质，也可以用作测定蛋白质的分子量。 超速：50000-120000rpm 第三节 蛋白质的沉淀分级  概念 溶液中溶质由液相变成固相析出的过程。 本质 通过改变条件使胶粒发生聚结，降低其在 液相中的溶解度，增加了固相中的分配率。 作用 分离、澄清、浓缩、保存 3.2 沉淀的分类 溶剂性质对沉淀的影响 3.3 沉淀的形成过程 文献选读 无定形沉淀形成示意 晶形沉淀过程示意 成核作用 3.4 沉淀微粒大小的影响因素 3.5 沉淀的纯度 表面吸附 表面吸附影响因素 包藏 occlusion 混晶或固溶体 后沉淀 共沉淀与后沉淀对分析结果的影响的处理 3.6 沉淀条件的选择 无定形沉淀 3.7 沉淀方法分类 盐析 有机溶剂沉淀 等电点沉淀 非离子聚合物沉淀 其他沉淀技术 3.7.1 盐析 3.7.1.1 原理 “盐溶” 低浓度中性盐离子对蛋白质分子表面极性基团及水活度的影响，增加蛋白质与溶剂相互作用力，使其溶解度增大。 “盐析” 中性盐浓度增加至一定值时，水分子定向排列