TCID50与moi值的计算.docVIP

实验四 病毒感染力的滴定（TCID50的测定） 一、实验目的 了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。 二、测定病毒感染力的方法 半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测 半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测 半数细胞培养物感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测 蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测 三、材料 1、长满单层的细胞1瓶 2、胰酶、吸球、吸管、生长液 3、96孔细胞培养板 4、加样器、枪头 5、病毒液（PRV） 四、TCID50的操作步骤 1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。 2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100μl。 3、在每孔加入细胞悬液100μl，使细胞量达到2~3×105个/ml。 4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100μl生长液+100μl细胞悬液） 5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。 6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法 五、TCID50的计算方法 1、Reed-Muench两氏法 病毒液稀释度 出现CPE孔数 无CPE孔数 累 计 出现CPE孔所占的% CPE孔数 无CPE孔数 10-1 8 0 27 0 100（27/27） 10-2 8 0 19 0 100（19/19） 10-3 7 1 11 1 91.6 （11/12） 10-4 3 5 4 6 40（4/10） 10-5 1 7 1 13 0.7（1/14） 10-6 0 8 0 21 0（0/21） CPE：Cytopathic effect 距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数） ? ＝（91.6-50）/（91.6-40） ＝ 0.8 lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数 =0.8×(-1)+(-3) =-3.8 TCID50=10-3.8/0.1ml 含义：将该病毒稀释103.8接种100μl可使50%的细胞发生病变。 2、Karber法 病毒液稀释度 出现CPE的孔数 出现CPE孔的比率 10-1 8 8/8=1 10-2 8 8/8=1 10-3 7 7/8=0.875 10-4 3 3/8=0.375 10-5 1 1/8=0.125 10-6 0 0/8=0 lgTCID50=L-d(s-0.5) L：最高稀释度的对数 D：稀释度对数之间的差 S：阳性孔比率总和 lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5) =-3.875 TCID50=10-3.875/0.1ml 含义：将该病毒稀释103.875接种100μl可使50%的细胞发生病变。 什么是MOI？MOI 是multiplicity of infection的缩写，中文译为感染复数。传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu。一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。?然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使MOI产生了不同的含义。能产生细胞裂解效应的病毒例如腺病毒、单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量，因此其MOI的含义与传统的概念相同。而对于某些病毒如AAV病毒，无法用pfu表示病毒的数量，而是采用TU、IU、病毒颗粒（viral particles, v.p）或基因组数量（vector genome,v.g.）来表示病毒数量，因此其MOI就有了不同含义。采用TU或IU，MOI的含义便是TU number/cell 或IU number/cell。采用v.p.，MOI的含义便是v.p. number/cell 。采用v.g，MOI的含义便是v.g. number/cell。?可以将上述不同的MOI 表示方式分为2种：?1） 以活性单位表示病毒数量，如pfu, TU, IU。这时MOI的含义是指平均每个细胞感染病毒的活性单位数。?2） 以病毒颗粒或基因组数表示病毒数量，如v.p. 或v.g. 。这时MO