2实验二 诱变剂的微核测试.pptVIP

湖州师范学院 生命科学学院生物系 一、实验目的 1、了解细胞微核形成的机理及其形态特点， 2、学习植物根尖细胞的微核检测技术。 二、实验原理 ※ 微核(micronuclei)简称MCN，是真核类生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。 ※微核形成:有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片不能向两极移动，游离于细胞质中，在间期细胞核形成时，在核产生一到几个很小的圆形结构—微核，直径大约是细胞直径的1/20～1/5。 三、实验材料 大蒜或蚕豆 五、实验步骤 1、幼根的培养 （1）大蒜：提前 3—5d进行培养，将大蒜瓣剥去外边膜质枯皮，下端可见许多微微凸起的根原体，将蒜瓣架在烧杯（大小与蒜瓣适宜）口上，杯中盛满清水，使蒜瓣的下部浸入水中，置培养箱中，注意每天换水，经3—5d后，即可长出1-2cm的嫩根。 （2）蚕豆：浸种24h，期间换水2次，25℃催芽，36-48h生根1-2cm。 五、实验步骤 2、处理根尖：阳性检测采用0.1g/L硫酸铜（大蒜）、0.5g/L重铬酸钾（蚕豆），对照用自来水处理，处理时间24h，处理液浸没根尖。 3、恢复培养：处理后的根尖用自来水浸洗3次，每次2-3min，洗净后在水中恢复培养24h。 4、固定：切取1cm左右的根尖，用甲醛：冰醋酸（3：1）固定液固定24h后弃去固定液，移入70％酒精中，4℃冰箱保存。 五、实验步骤 5、酸解：弃去固定液，用蒸馏水漂洗2-3次，吸净水，加入6M盐酸浸没根尖，于室温解离10min，弃去盐酸，漂洗根尖2-3次，彻底洗净盐酸。 6、染色：截下1-2mm长的根尖，滴加适量的石炭酸品红染液，染色10min，加盖玻片，压片观察，记录有微核的细胞数目。 六、实验结果 采用如下标准进行分析以确定样品的污染程度：MCN‰在10‰以下，表示基本没有污染；MCN‰在10‰－18‰区间，则表示有轻度污染；MCN‰在18‰－30‰区间，则表示有中度污染；MCN‰在30‰以上，则表示有重度污染； 七、作 业 ★上交实验报告:包括绘图、计算微核千分率和污染指标。 八、思考题 1、在植物细胞的微核检测实验中，为什么要进行24h的恢复培养？ 2、产生微核的根尖细胞在产生前的分裂中期可能出现什么样的中期分裂图像？ * 《遗 传 学》校 级 精 品 课 程 微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关 ，因此，微核是常用的遗传毒理学指标之一，指示染色体或纺锤体的损伤。微核测试已用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体 遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。 二、实验原理 显微镜、恒温培养箱、恒温水浴锅、镊子、载玻片及盖玻片等。 盐酸、甲醇、石炭酸品红、硫酸铜、重铬酸钾。 四、实验仪器设备及药品 1、微核形成与识别：首先在低倍镜中找到分生组织区细胞分散均匀，分裂相较多的部位，再转高倍镜观察，找到微核。 （1）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。（2）小核着色与主核相当或稍浅。（3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则型。 1、微核形成与识别 微核 微核 1、微核形成与识别 1、微核形成与识别 2、微核千分率（ MCN‰ ） 每一处理观察3个根尖，每个根尖计数100个-300细胞，统计其中含的细胞数，计算平均数，即为该处理的微核千分率。 六、实验结果 平均微千分率 总 计 微核数 细胞数 微核数 细胞数 微核数 细胞数 各自观察的细胞数或微核数 第三片 第二片 第一片 片 号 蚕豆（大蒜）根尖微核检测记录表 样品实测MCN‰平均值 对照组（标准水）MCN‰平均值 3、污染指标 = （PI） 六、实验结果 * 《遗 传 学》校 级 精 品 课 程