细胞凋亡的分子生物学检测方法.pdfVIP

中国试剂网 3.9.231 细胞凋亡的分子生物学检测方法 细胞凋亡中染色体DNA 的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA 首 先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb 的大片段。然后大约30 ﹪的 染色体DNA 在Ca ²+和Mg²+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被 随机切断，形成180～200bp 核小体DNA 多聚体。DNA 双链断裂或只要一条链 上出现缺口而产生的一系列DNA 的3’-OH 末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶 （TdT ）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或 生物素形成的衍生物标记到DNA 的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类 方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法 （TUNEL ）。由 于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的断裂，因而没有3’-OH 形成，很少 能够被染色。低分子量的DNA 分离后，也可使用DNA 聚合酶进行缺口翻译（nick translation ），使低分子量的DNA 标记或染色，然后分析凋亡细胞。TUNEL 或缺 口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细 胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态 特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的 细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化 学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。 一、过氧化物酶标记测定法 原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[ （digoxigenin ）-11-dUTP]在TdT 酶的 作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA 的3-OH 末端，与dATP 形成异 多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。 在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在 凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察。 毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高 辛杭体结合的配体，因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物 甾体激素的交叉反应不到 1％，若此抗体的 F 部分通过蛋白酶水解的方法除去 后，则可完全排除细胞F 受体非特异性的吸附作用。 本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或 从组织中分离的细胞凋亡测定。 中国试剂网 3.9.231 (一)试剂配制 1、磷酸缓冲液PBS （pH7.4 ）：磷酸钠盐 50mM ，NaCl 200mM 。 2 、蛋白酶K （200 μg/ml，pH7.4 ）：蛋白酶K 0.02g ；PBS 100ml 。 3、含2%H2O2 的PBS 缓冲液 （pH7.4 ）：H2O2 2.0ml ；PBS 缓冲液 98.0ml 。 4 、TdT 酶缓冲液 （新鲜配）：Trlzma 碱 3.63g 用 0.1N HCl 调节pH 至 7.2 ，加 ddH2O 定容到1000ml；再加入二甲砷酸钠 29 ．96g 和氯化钴0.238g 。 5、TdT 酶反应液：TdT 酶32 μl ；TdT 酶缓冲液 76 μl，混匀，置于冰上备用。 6、洗涤与终止反应缓冲液：氯化钠 17. 4g ；柠檬酸钠 8.82g ；ddH2O 1000ml 7、0.05 ％二氨基联苯 （DAB ）溶液：DAB 5mg ；PBS 10ml ，pH7.4, 临用前过滤 后，加过氧化氢至0.02% 。 8、0.5 ％甲基绿 （pH4.0 ）：甲基绿0.5g；0.1M 乙