细胞生物学实验指导(12生工).docVIP

细胞生物学实验 教案 实验一：特殊显微镜的使用及显微摄影术 一、实验目的： 1、掌握暗视野显微镜、相差显微镜的原理、构造及其使用方法。2、掌握显微摄影装置及其操作技术，独立完成显微摄影全过程。 二、实验原理： 暗视野显微镜应用丁达尔现象，装配暗示场聚光器，是入射光从聚光器斜向照明被检样品。暗视野显微镜利用样品的散射光和放射光进行观察，只能观察物体的存在与运动而不能辨清其细微结构。暗视场照明是照明光线仅照亮被检样品而不能进入物镜，使视场背景暗黑，样品明亮的照明方法。 相差显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检，通过衍射和干涉现象，将肉眼看不到的相差，变为明暗的振幅差而能看到。相差显微镜应用于生物学的主要价值，在于对透明的活体进行直接观察，无需采用是细胞致死的固定和染色的方法。 0lympus BH系列的BHS和BHT型显微镜有摄影装置，通过摄影装置，拍摄显微视场中被检样品。 三、实验仪器与试剂 1、材料：洋葱鳞茎、人口腔细胞； 2、器材：暗视场显微镜、相差显微镜、Olympus显微镜、活体生物样品、擦镜纸、消毒牙签、镊子、滴管、纱布、吸水纸、载玻片、盖玻片 3、试剂：生理盐水（0.9%）、2%碘液、香柏油、二甲苯。 四、实验步骤与方法 （一）口腔上皮细胞的制备及染色 1、把载玻片和盖玻片擦拭干净； 2、用滴管在载玻片的中央滴一滴生理盐水； 3、用消毒牙签在自己漱净的口腔内壁轻轻地刮几下； 4、把牙签上的碎屑放在生理盐水中轻涮几下； 5、盖上盖玻片； 6、在盖玻片的一侧滴一滴稀碘液； 7、用吸水纸吸引,使染液浸润标本的全部。 （二）洋葱鳞茎内表皮装片制作 1、把载玻片和盖玻片擦拭干净； 2、用滴管在载玻片的中央滴一滴蒸馏水； 3、用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮置于蒸馏水中； 4、盖上盖玻片； 5、在盖玻片的一侧滴一滴稀碘液； 6、用吸水纸吸引,使染液浸润标本的全部。 （三）分别用暗视场显微镜和相差显微镜观察 （四）显微摄影的使用 将装片置于显微摄影镜下,选一清晰的视野进行拍摄并打印出来。 作 业：交一张显微摄影相片，并贴在实验报告上。 思考题：为什么暗视场照明的视场暗黑，而样品像明亮？相差显微镜镜检时，为什么要用绿色滤色镜观察活体样本？ 实验二：类坏死细胞的处理及死活细胞鉴别 一、实验目的： 1、学习并掌握细胞计数原理及方法；2、学习并掌握类坏死细胞的处理方法；3、学习并掌握死活细胞鉴别的原理及方法。 二、实验原理： 1、类坏死细胞是细胞介于生活和死亡之间的临界状态。引起类坏死的方法多种多样，如高温、冷冻、紫外线照射、酸碱处理等。类坏死和死亡之间的区别在于前者发生的变化是可逆的，而后者是不可逆的。 2、血球计数板是用以计数红细胞和白细胞的。四个边角大方格，都用以计数白细胞的，而正中间的大方格则是用以计数红细胞的。 3、死活细胞鉴别有许多不同的方法，其中最常用方法是染色排除法。其原理是许多酸性染料不易穿过活细胞的质膜进入细胞内，却能进入死亡的细胞内，使其着色，以此来鉴别死活细胞。 三、实验器材与试剂： 1、材料：鸡血细胞。 2、实验器材：显微镜、血细胞计数板、水浴锅。 3、试剂：5%柠檬酸钠、1%台盼蓝溶液（生理盐水配置）、Ringer液、HanK液、0.1mol/L CH3COOH（HanK液配制）、0.001 mol/LNH3（Ringer液配制）、 四、实验步骤与方法： 类坏死细胞的处理。 1、碱处理： A、取5支试管编号，分别加入1 ml鸡血细胞悬液； B、分别加入1 ml0.001 mol/LNH3混匀，37℃培养1、5、10、20、30min。 C、加入5 ml Ringer液离心（800~1500r/min ）5min去上清液，重复2次，再加入1 ml Ringer液。 2、酸处理： A、取5支试管编号，分别加入1 ml鸡血细胞悬液； B、分别加入0.05、0.10 、0.15、 0.20 、0.40 ml 0.1mol/LCH3COOH混匀，37℃培养10 min。 C、加入5 ml HanK液离心（800~1500r/min ）5min去上清液，重复2次，再加入1 ml HanK液。 （二）染色制片： 取0.5ml细胞悬液放入干净试管中，加入约0.1ml（1~2滴）染液，混匀，2min后立刻加入血细胞计数室，镜检计数。 （三）观察结果：死细胞染成蓝色，活细胞不着色。根据下式求细胞活力： 细胞存活率（%）=（细胞总数-死细胞数）÷细胞总数×100% 作业：书写实验报告，计算所测细胞成活率。 思考题：为什么活细胞不易染色，从细胞生物学角度解释原因。 附：HanK液的配制： HanK原液：NaCl 80.0g; Na2HPO4.2H2O 0.6g; KCl 4.0g;KH2PO4 0.6g; MgSO