RNA结合蛋白和转录后调控.ppt

RNA结合蛋白与转录后调控 王文恭 AUF1 也叫HnRNPD（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D). 主要位于核内，但可穿梭于核/细胞浆间，结合I，II类AREs。 结合目标mRNA 后使之不稳定（易于降解），如P21， CyclinD1，也可使目标稳定，如TNF-alpha。 TTP 与HuR及AUF1不同，TTP主要位于细胞浆，结合II类AREs。 结合目标后主要使目标不稳定。如：COX-2，TNF-alpha,GM-CSF,等。 Interaction of the factors involving in post-transcriptional regulation 1. RNA结合蛋白相互作用。 如， HuR与AUF1均可结合于p21 与cyclin D1 3’UTR， 但二者有竞争，且功能相反。 2. RNA结合蛋白与microRNA间相互作用。 如， HuR与let-7, miR-122, TTP与miR-16 。 RNA-蛋白质相互作用(结合)的特点 可在细胞核, 也可在细胞浆 发生在核与胞浆的结合功能截然不同, 如在胞浆与翻译及mRNA稳定性有关, 在核可能与拼接或成熟有关. RNA结合蛋白对目标的序列要求不如DNA 结合蛋白般严格. 结合部位大多在3’-UTR, 少数在5’-UTR,绝少见于CDS. mRNA稳定性（turnover）研究的特殊技术 蛋白质-RNA结合试验： 1）目标Transcript 的体外转录与标记 2）细胞浆抽提物的制备。 3) EMSA (gel-shift, supershift) 4) rChip, pull-down assays (using paramagnetic streptavidin dynabeads, biotinyl-labeled transcripts) mRNA半衰期测定 基本思路:终止转录后,收取不同时间点之RNA, 定量分析RNA降解速率. 1）用ActinomycinD终止转录 2）Tet-off/on （或类似）报告基因系统 3) in vitro RNA降解分析 Tet-on system is activated in the presence of doxycycline TET-OFF in details Reference Barreau, etal; Nucleic Acids Research, 33(22): 7138-7150, 2005 2) 3) Wang, et al; MCB, 20:760-769, 2000 4) Lal, et al; EMBO J., 23:3092-3102, 2004 HuR Regulates p21 mRNA Stabilization by UV LightWang, et al; Mol Cell Biol. 2000， 20(3): 760–769. 细胞暴露于多种应激（Stresses）如short-wavelength UV light (UVC)时, cyclin-dependent kinase inhibitor p21的表达明显被诱导。 P21 的调控，尤其P53调节的转录已被广泛，深入研究。 先前的研究发现，UVC可通过P53-不依赖的方式诱导P21。研究还发现，细胞暴露于UVC后，p21 mRNA 稳定性增加。 问题： UVC诱导P21表达（稳定性增加）的机制如何？ 与HuR有关否？ Summary UVC在不影响总HuR水平的条件下诱导细胞浆HuR水平 UVC诱导HuR与p21 mRNA 的结合 HuR 结合P21 3’-UTR后使P21mRNA 稳定性增高，进而引起P21表达增高。 人为降低HuR水平可降低HuR与P21 3’-UTR间的相互结合，降低P21mRNA 稳定性，降低P21表达，提示HuR对UVC诱导的P21 mRNA 稳定性是必须的。 Conclussion UVC induces p53 translation. HuR binds to the 3’UTR of p53. HuR enhances p53 translation under UVC treatment. AUF1 binds to p16 3’-UTR. Binding of AUF1 to p16 3’-UTR attenuated with cellular senescence. AUF1 levels reduced with cellular senescence. AUF1 binds to AU rich region