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实验八 多糖结构分析 多糖在生物学上的重要意义，尤其是在医药学上的重要意义决定了多糖研究的迅速发展，多糖构效关系的研究已成为多糖研究的热点。但由于多糖结构的复杂性和多样性，其结构测定远远落后于蛋白质和核酸,本实验选择天然多糖（半乳葡萄甘露聚糖）作为实验材料，对其一级结构做初步的分析。 多糖一级结构的分析包括：纯度鉴定，分子量测定，单糖组成测定和糖链的序列测定。糖链的序列测定包括：单糖残基在糖链中的次序，单糖残基间连键的位置，链的分支情况等诸多方面。 【实验目的】 1.了解多糖结构分析的内容及方法。 2.了解多糖一级结构分析的基本原理。 3.掌握多糖一级结构分析的基本方法。 一、490nm处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。 【实验材料】 1. 实验器材 721型分光光度计。 2. 实验试剂 98％80％80g苯酚加20ml水使之溶解，可置冰箱中避光长期贮存。 6％80％0.1 mg/ml）：取100mg葡萄糖，用蒸馏水溶解，定容至1L。 多糖样品：半乳葡萄甘露聚糖溶液（0.1 mg/ml）。 【实验操作】 1. 制作标准曲线： 取9支干燥试管，按下表操作 管号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 标准溶液（ml0 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 蒸馏水（ml） 2.0 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 6％苯酚（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 浓硫酸（ml） 5 5 5 5 5 5 5 5 5 静止10分钟，摇匀，室温放置20分钟 A490 横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，绘制标准曲线。 2. 样品含量测定： 取样品液1.0ml，3．计算: 糖含量(%)=C /（C0× V）×100%C: 由标准曲线查得的糖微克数 C0：（0.1 mg/ml）V：1.0ml） 二、单糖组成分析 【实验原理】 多糖在浓硫酸中保温一定时间可完全水解为单糖，通过纸层析分离，特定试剂显色后与已知糖的标准混合物作对比，可以鉴定多糖水解产物中单糖的组成。 【实验材料】 1. 实验器材 水解管；滤纸；玻璃毛细管；层析缸；喷雾器。 2. 实验试剂 ⑴ 标准糖溶液: 称取一定量的半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖，用蒸馏水溶解，得标准糖混合溶液(每种糖的点样量为20微克~30微克)。 ⑵ 展层剂： 正丁醇：乙酸：水=4：l：5 1.6g溶于水饱和的正丁醇100 ml，加苯胺0.93g（相当于0.9 ml）。 ⑷ BaCO3；1mol/L硫酸。 【实验操作】 l．完全酸水解： 称取20 mg多糖样品，加入1mol/L H2S04 2ml；封管，l00℃水解8小时，然后加入BaC03中和，定量滤纸过滤，滤液留作分析。 2．纸层析： 将层析滤纸剪成7cm×40cm的纸条，距层析滤纸一端2cm处画一横线作为点样线,在点样线上画两个点分别作为标准糖溶液和多糖水解液的点样位置。用玻璃毛细管点样，斑点尽可能小，而且每点一滴，待点样点干燥后，在同一位置再点第二滴。然后将滤纸条悬挂于层析缸中进行层析，展层时间约为36小时。 3．显色： 将滤纸取出，自然干燥，喷上苯胺-邻苯二甲酸-正丁醇饱和水溶液，100℃条件下15分钟即可显色。标准单糖混合物色斑在滤纸上由下而上的顺序是：半乳糖-葡萄糖-甘露糖-阿拉伯糖。与标准单糖混合物色斑比较，即可判断多糖样品的单糖组成。 三、糖链的序列测定 （一）高碘酸氧化 【实验原理】 高碘酸可以选择性地氧化和断裂糖分子中连二羟基或连三羟基处，生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸。反应定量地进行，每开裂—个C-C键消耗一分子高碘酸。通过测定高碘酸消耗量及甲酸的释放量，可以判断多糖分子中糖苷键的位置、类型、多糖的分枝数目和取代情况等。 【实验材料】 1. 实验器材 紫外分光光度计。 2. 实验试剂 溴甲酚蓝指示剂:0.1克溴甲酚蓝溶于250ml蒸馏水中（含1.43毫升0.1mol/L氢氧化钠）。 30mmol/L高碘酸钠溶液。 乙二醇。 0.01mol/L氢氧化钠溶液。 【实验操作】 1. 制作标准曲线： 取6支干燥试管，按下表操作 管号 0 1 2 3 4 5 高碘酸钠（ml） 0 0.5 1.0 1.5 2.0 4.0 蒸馏水（ml） 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 0 各取0.1 ml，定容至25 ml，在223nm处测定光密度 A223 横坐标为高碘酸钠毫摩尔数，纵坐标为光密度值，绘制标准曲线。 2. 样品测定 称取多糖样品25mg，用少量水溶解，加入30mmol/L高碘酸钠溶液,定容至25ml，置于暗处,室温下进行反应，于0，6，12，24，36