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多糖结构分析
实验八 多糖结构分析
多糖在生物学上的重要意义,尤其是在医药学上的重要意义决定了多糖研究的迅速发展,多糖构效关系的研究已成为多糖研究的热点。但由于多糖结构的复杂性和多样性,其结构测定远远落后于蛋白质和核酸,本实验选择天然多糖(半乳葡萄甘露聚糖)作为实验材料,对其一级结构做初步的分析。
多糖一级结构的分析包括:纯度鉴定,分子量测定,单糖组成测定和糖链的序列测定。糖链的序列测定包括:单糖残基在糖链中的次序,单糖残基间连键的位置,链的分支情况等诸多方面。
【实验目的】
1.了解多糖结构分析的内容及方法。
2.了解多糖一级结构分析的基本原理。
3.掌握多糖一级结构分析的基本方法。
一、490nm处有最大吸收,吸收值与糖含量呈线性关系。
【实验材料】
1. 实验器材
721型分光光度计。
2. 实验试剂
98%80%80g苯酚加20ml水使之溶解,可置冰箱中避光长期贮存。
6%80%0.1 mg/ml):取100mg葡萄糖,用蒸馏水溶解,定容至1L。
多糖样品:半乳葡萄甘露聚糖溶液(0.1 mg/ml)。
【实验操作】
1. 制作标准曲线:
取9支干燥试管,按下表操作
管号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 标准溶液(ml0 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 蒸馏水(ml) 2.0 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 6%苯酚(ml) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 浓硫酸(ml) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 静止10分钟,摇匀,室温放置20分钟 A490
横坐标为多糖微克数,纵坐标为光密度值,绘制标准曲线。
2. 样品含量测定:
取样品液1.0ml,3.计算:
糖含量(%)=C /(C0× V)×100%C: 由标准曲线查得的糖微克数
C0:(0.1 mg/ml)V:1.0ml)
二、单糖组成分析
【实验原理】
多糖在浓硫酸中保温一定时间可完全水解为单糖,通过纸层析分离,特定试剂显色后与已知糖的标准混合物作对比,可以鉴定多糖水解产物中单糖的组成。
【实验材料】
1. 实验器材
水解管;滤纸;玻璃毛细管;层析缸;喷雾器。
2. 实验试剂
⑴ 标准糖溶液: 称取一定量的半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖,用蒸馏水溶解,得标准糖混合溶液(每种糖的点样量为20微克~30微克)。
⑵ 展层剂: 正丁醇:乙酸:水=4:l:5 1.6g溶于水饱和的正丁醇100 ml,加苯胺0.93g(相当于0.9 ml)。
⑷ BaCO3;1mol/L硫酸。
【实验操作】
l.完全酸水解:
称取20 mg多糖样品,加入1mol/L H2S04 2ml;封管,l00℃水解8小时,然后加入BaC03中和,定量滤纸过滤,滤液留作分析。
2.纸层析:
将层析滤纸剪成7cm×40cm的纸条,距层析滤纸一端2cm处画一横线作为点样线,在点样线上画两个点分别作为标准糖溶液和多糖水解液的点样位置。用玻璃毛细管点样,斑点尽可能小,而且每点一滴,待点样点干燥后,在同一位置再点第二滴。然后将滤纸条悬挂于层析缸中进行层析,展层时间约为36小时。
3.显色:
将滤纸取出,自然干燥,喷上苯胺-邻苯二甲酸-正丁醇饱和水溶液,100℃条件下15分钟即可显色。标准单糖混合物色斑在滤纸上由下而上的顺序是:半乳糖-葡萄糖-甘露糖-阿拉伯糖。与标准单糖混合物色斑比较,即可判断多糖样品的单糖组成。
三、糖链的序列测定
(一)高碘酸氧化
【实验原理】
高碘酸可以选择性地氧化和断裂糖分子中连二羟基或连三羟基处,生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸。反应定量地进行,每开裂—个C-C键消耗一分子高碘酸。通过测定高碘酸消耗量及甲酸的释放量,可以判断多糖分子中糖苷键的位置、类型、多糖的分枝数目和取代情况等。
【实验材料】
1. 实验器材
紫外分光光度计。
2. 实验试剂
溴甲酚蓝指示剂:0.1克溴甲酚蓝溶于250ml蒸馏水中(含1.43毫升0.1mol/L氢氧化钠)。
30mmol/L高碘酸钠溶液。
乙二醇。
0.01mol/L氢氧化钠溶液。
【实验操作】
1. 制作标准曲线:
取6支干燥试管,按下表操作
管号 0 1 2 3 4 5 高碘酸钠(ml) 0 0.5 1.0 1.5 2.0 4.0 蒸馏水(ml) 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 0 各取0.1 ml,定容至25 ml,在223nm处测定光密度 A223 横坐标为高碘酸钠毫摩尔数,纵坐标为光密度值,绘制标准曲线。
2. 样品测定
称取多糖样品25mg,用少量水溶解,加入30mmol/L高碘酸钠溶液,定容至25ml,置于暗处,室温下进行反应,于0,6,12,24,36
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