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PKCζ降低表达削弱了 乳腺癌细胞的趋化运动和黏附能力1 万五洲，张宁 北京大学化学与分子工程学院化学生物学系，北京(100871) E-mail: nzhangchina@ 摘 要： 目的研究蛋白激酶 C ζ (PKCζ) 降低表达对乳腺癌细胞趋化运动和黏附能力的影 响。 方法 利用 RNA 干扰技术特异性降低 PKCζ 蛋白在乳腺癌 MDA-MB-231 细胞中的表 达，通过滤膜小室法 (Mircro-Boyden Chamber) 检测细胞的趋化运动能力，通过细胞黏附实 验检测细胞的黏附能力。 结果 RNA 干扰有效的降低了乳腺癌 MDA-MB-231 细胞中PKCζ 蛋白的表达。在表皮生长因子受体 (EGFR) 诱导下，与参照细胞相比，PKCζ降低表达后的 细胞趋化运动能力和黏附能力都显著下降。 结论 PKCζ 降低表达削弱了乳腺癌细胞的趋化 运动能力和黏附能力。 关键词：蛋白激酶C ζ，表皮生长因子受体，乳腺癌，趋化运动，黏附 中图分类号：R737 1. 引言 PKCζ 是蛋白激酶C (PKC) 家族的成员之一，属于非典型性PKC ；与经典型PKC和新型 PKC不同，PKCζ的激活不依赖于钙离子 (Ca2+) 或二酯酰甘油 (DAG)[1] 。研究表明，PKCζ 在细胞的凋亡、极化及黏附过程中都发挥着重要作用：在人Caco-2 细胞中，PKCζ 可以抑 制胶原蛋白依赖性及不依赖性的细胞增殖，促进细胞凋亡[2] ；在星形胶质细胞的迁移过程 中，PKCζ 与Par6/Cdc42 形成了复合物，共同控制细胞的极化[3,4] ；在嗜中性粒细胞的运动 过程中，PKCζ 可能还参与了Gi 蛋白所诱导的细胞黏附和肌动蛋白聚集过程[5] 。许多肿瘤 细胞，如乳腺癌、肺癌、胃癌等的恶性转化都和细胞内 PKC 的表达水平升高或突变有关， 但是对于PKC在癌细胞运动过程中的作用目前还研究较少[6] 。本文以乳腺癌MDA-MB-231 细胞为模型，探讨了PKCζ降低表达对乳腺癌细胞趋化运动能力和黏附能力的影响。 2. 材料和方法 2.1 MDA-MB-231 细胞的培养和传代 人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞购自美国细胞菌种库 (American Type Culture Collection, ATCC) (Manassas, VA, USA) ，来源是人乳腺器官，属于上皮细胞腺癌。该细胞的表皮生长 因子受体 (EGFR) 表达呈阳性，是研究 EGFR 诱导癌细胞转移的理想模型。细胞培养采用 加了 Penicillin-Streptomycin 和10% FCS 的RPMI1640完全培养基，在37 ºC、5% CO2饱和湿 度培养箱中培养。待细胞融合后用0.1%胰酶/EDTA 消化传代。 —————————— 1本课题得到高等学校博士学科点专向科研基金（20040001019 ）资助。 - 1 - 2.2 载体构建 PKCζ siRNA 质粒是利用 pRNAT-U6.1/Hygro 作为表达载体，正义链(5→3): GGAAGUGAGAGACAUGUGUTT ；反义链 (5→3): ACACAUGUCUCUCACUUCCTC 。该 序列是针对基因上的特异靶点所设计，一段和 siRNA 同样长度的随机序列被插入此载体作 为参照。这些质粒均直接购自GenScript 公司 (Piscatwaway, NJ, USA) ，载体可以同时表达 绿色荧光蛋白，作为细胞筛选的标记。 2.3 细胞转染以及单克隆细胞系的建立 利用转染试剂LipofectamineTM 2000 转染siRNA进入乳腺癌细胞：1）转染前一天，在 不包含抗生素的适量RPMI1640 完全培养基中接种细胞，转染时细胞的汇合度要达到 80-90 ％；转染前两小时，换成无血清无双抗的R