ww复方丹参滴丸对缺氧心肌细胞内钙离子平均荧光强度的影响.pdfVIP

中国病理生理杂志. 2001,17(7):690-691 复方丹参滴丸对缺氧心肌细胞内钙离子平均荧光强度的影响 李全凤，王孝铭，朱世军，艾静，高焕焕，徐长庆 （哈尔滨医科大学病理生理教研室，药理教研室，黑龙江哈尔滨 150086） ［主题词］中草药;荧光；钙;离子；心肌;细胞；低氧 [摘要]目的：探讨复方中药丹参滴丸对缺氧／复氧心肌细胞的保护作用。方法：培养的乳 鼠心肌细胞，用钙探针Flou-3/AM 染色，利用激光扫描共聚焦显微镜观察心肌细胞缺氧／复 氧及在复方丹参滴丸保护作用下心肌细胞内钙离子荧光强度变化．结果：缺氧加丹参保护组， 细胞内钙离子荧光强度（1217.78±312.07）明显低于单纯缺氧组（1509.43±508.58）；缺 氧复氧加丹参组，细胞内钙离子荧光强度为（1567.91±577.61），亦较缺氧再给氧组（ 1617.6 ±477.53）低。结论：复方丹参滴丸对缺氧心肌细胞有明显保护作用。 ［中图分类号］ R364.4 ； R285.5 ［文献标识码］A 本教研室多年来就复方丹参对缺血／再灌注心肌的保护作用机制进行了大量研究[1-3] ，以 整体、器官、细胞、细胞器为模型，从形态、能量代谢等不同角度深入探讨。复方丹参制剂 可使心肌缺血、缺氧得到明显改善。本实验采用乳鼠心肌细胞培养 36 h ，使心肌细胞缺氧 ／复氧，加入复方丹参滴丸保护，利用共聚焦显微镜观察复方丹参滴丸对心肌细胞缺氧／复 氧时的抗“钙超载”作用。 材料和方法 1.试剂 1．1 1 640 培养液 美国 Gibco 公司产品。 1．2 胎牛血清 中国医学科学院血液病研究所。 1．3 胰蛋白酶 Difco 进口分装。 1．4 Fluo-3 ／AM 日本东京株式会社同仁化学研究所。 1．5 复方丹参滴丸 天津天士力制药集团。 2.细胞分离和培养 取新生的Wistar 大鼠的乳鼠（本校动物实验中心提供），在无菌条件下取出心脏，剪碎， 加入0 ．25 ％胰蛋白酶消化液消化 30min ，上清液吸出，用 Hanks 液清洗、离心，共 3 次。 清洗后的细胞用 1640 培养液制成混悬液，加入 15 ％小牛血清，分装培养瓶内，每瓶细胞 6 0 计数按 10 计算。放入 37 C 温箱内培养。 3.分组 培养36 h 的细胞放在倒置显微镜下观察；视野清晰，细胞生长良好，大部分细胞有搏 动。将这些细胞随机分成 5 组。①正常对照组 （I ）；②缺氧10 min 组（II ）；③缺氧10 min 加丹参组 〔Ⅲ〕；④缺氧10min ／复氧 10min 组（IV ）；⑤映氧 10 min ／复氧 10 min 加丹参 组（V ）.缺氧组：直接向培养瓶内给氮气10min ；缺氧／复氧组：先给氮气10min 再给氧气 10min ；保护组：给氮气之前将药物加入瓶内，气体流量为每分钟100 个气泡（气泡直径为 lmm 左右）。复方丹参滴丸终浓度为 40 mg ／L 。 4.细胞染色 经过处理后的细胞，用 0.25 ％胰蛋白酶从培养瓶内消化下来，清洗、离心后加入10 μ mol ／ L 的Fluo －3 ／AM 染色；在37℃恒温水浴锅内孵育lh 。每隔10min 振荡 1 次，使染 液均匀进入细胞内。染色结束后，再用PBS 缓冲液清洗，离心，共3 次，最后加入无血清， 无酚红 1640 培养液内，以备扫描。 ２＋］i 荧光指示剂，用Fluo －3 ／AM(戊二酰氧甲基脂) Fluo-3 ／ AM 是一种新的［Ｃａ 即脂化的 Fluo-3 荧光染料负载细胞时，可穿透细胞膜，细胞内的脂酶将其水解，释放出 Fluo-3,与细胞内钙离子结合，产生荧光。 5.共聚焦显微镜观察 同Fluo-3/AM 染色后的细胞，放在共聚焦显微镜（美国 MERIDIAN 公司 INSINGHT PLUS ）下，通过显微镜发出的488 nm 波长的氩离子激光，激发细胞内与染料结合的游离钙 离子，产生荧光。可看到细胞内钙离子分布情况。 6.统计学处理 检测数据以x ± s 表示，用ｔ检验进行分析。