体外翻译系统在分子生物学研究中的应用.pdfVIP

·18· 垦盐堕兰塑士生塑了分册2052印璺!!墨兰—L塑 体外翻译系统在分子生物学研究中的应用 李前综述孙曼霁审阅Q1A 军事医学科学院毒物药物研究所(北京．100850) 摘要体外翻译系统卫称无细胞蛋白质合成系统，是分子生物学中一种常规的表达系统。该系统可用于蛋白 质快速分析鉴定．基因转录和翻译的调控机理的研究“及分子问的相互作用的研究，如蛋白质和蛋白质的相互作 用，蛋白质与DNA的相互作用，蛋白质与RNA的相互作用等。 关链词 体外翻译系统；基因表达调控 体外翻译系统叉称无细胞蛋白质合成系统，是 二烯化，蛋白酶水解和一些磷酸化活性。信号肽切除 一种相对胞内表达系统而言的开放表达体系。翻译 以及蛋白质糖基化等翻译后加工事件町以通过加入 系统内的组分和翻译条件可以根据需要进行适当的 犬微粒体膜来实现o]。 改变，因而体外翻译系统中翻译特定的基因较胞内 1．2．1利用兔网织红细胞体外翻译系统进行蛋白质 表达系统具有许多优点如内源性mRNA干扰很小表达鉴定 兔网织红细胞体外翻译系统对外源基因 (由于体外翻译系统是用指定的模板进行目的蛋白 进行表达具有简单、快速的优点，常被应用于对所构 质合成，因而可以大大降低或消除在体内翻译系统 建的基因进行快速鉴定，通过SDSPAGE检测翻译 中由于内源mRNA所造成的背景)；可以同时加人后蛋白质分子量的大小以证实基因的读码框架是否 多种基因模板研究多种蛋白质的相互作用；体外翻 正确，以及基因表达的蛋白质是否存在错义突变．大 译系统可以对基因产物进行特异性标记，便于在反 小是否完整，或通过测定表达产物的活性进行鉴 应混合物中检测。此外体外翻译系统是一种蛋白质 定口“一。PCR技术结合体外转录和翻译系统可以使 快速鉴定系统，蛋白质表达可以不需要先进行克隆。 基因不需要先克隆而直接进行表达“一。许多基因疾 目前．体外翻泽系统有兔网织红细胞系统、麦胚提取 病和肿瘤都是突变的结果，如终止密码子突变．移码 物系统、￡．coli$30系统3种。 或基因片段缺失，一般都导致截断的基因产物。一般 需通过测序来鉴定是否突变，这是最可靠的检测方 1 真核体外翻译系统在分子生物学研究中 法。但要对许多样品筛选．测序工作量则太大。在 的应用 l993年，Roesl等发展了一种蛋白质截断试验．在体 1．1兔网织红细胞系统 外翻译系统中快速而简单地对这些截断的突变体进 体外翻译系统中兔网织红细胞系统是真核体外 行筛选“o。 翻译系统中应用最广泛的一种，常用于较大的mR— 1．2．2研究影响蛋白质翻译过程和翻译后加工的因 NA种类鉴定．基因产物性质的分析，转录和翻泽调 素 利用体外翻译系统的开放特性可以在翻译前， 控的研究，以及共翻译加工的研究等等。兔网织红细 翻译过程中，以及翻译后添加各种蛋白质、核酸、药 胞用新西兰大白兔制备“j，通过纯化除去兔网织红 物、无机离子等(如在体外翻译后加人蛋白酶，研究 细胞以外的污染细胞。网织红细胞裂解后，提取物用 产物的抗蛋白酶水解作用“，或加人适当的离子，研 微球菌核酸酶破坏内源mRNA，最大限度降低翻译究产物的活性与离子的关系”1)．或是改变反应的温 背景。裂解物包含蛋白质合成所必须的细胞内组分 度、时间等翻译过程中的影响因素．以研究表达产物