痕量还原性辅酶I的抑制荧光法测定.pdfVIP

( ) 第 32 卷 分析化学 FENXI HUAXU E 　研究报告 第 6 期 　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　 2004 年 6 月 Chinese Journal of Analytical Chemistry 719～723 痕量还原性辅酶 I 的抑制荧光法测定 陈亚红　蔡汝秀 (武汉大学化学与分子科学学院 ,武汉 430072) ( ) 摘 　要 　基于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 简称辅酶 I ,NADH 对血红蛋白催化 H O 氧化 L 酪氨酸的反应具有 2 2 强烈的抑制作用 ,提出了一种新的测定 NADH 的荧光分析法。该方法灵敏 ,简单 ,其线性范围为 5. 0 ×10 - 8 ～ 2. 0 ×10 - 6 mol/ L ;检出限为 2. 0 ×10 - 8 mol/ L 。进一步探讨了NADH 对血红蛋白催化反应的抑制机理 ,其抑 制类型属于竞争性抑制。 关键词 　辅酶 Ⅰ,抑制荧光法 ,血红蛋白 1 　引　　言 ( ) 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 简称辅酶 Ⅰ,NADH 广泛存在于一切动物、植物和微生物的活细胞中 ,是 目前已知的300 多种脱氢酶的辅酶 ; 同时 ,它也是许多生物氧化还原电子传递链中的重要物质 ,对活化 生物体内多酶系统 ,促进核酸、蛋白、多糖的合成和代谢 ,增加物质转运和调控 ,改善代谢功能有重要作 用1 。因此 ,建立准确、灵敏、简单的 NADH 测定方法在生物、生命和生理过程研究方面有重要的意义。 目前测定NADH 大多采用电化学法2 ～4 ,分光光度法5 及化学发光法6 ,7 等。但这些方法有的灵敏度 较低 ,有的操作比较繁琐。 NADH 是一种强荧光物质 ,其最大激发波长和发射波长分别为 340 和 460 nm ,而 NAD + 则无荧光。 NADH 的这一特性为其荧光分析法奠定了基础 ,因而很早就建立了 NADH 的荧光测定法8 ,但方法的 灵敏度较低。间接法则是在吩嗪甲酰硫酸酯或心肌黄酶存在下 ,NADH 将无荧光的刃天青还原为强荧 光的试卤灵 ,再测定后者的荧光9 。该法比利用NADH 自身荧光的直接测定法灵敏度显著提高,能够 分析 2 ×10 - 7 ～2 ×10 - 5 mol/ L 的 NADH 。随后 Zhou 等10 改进了此测定方法 ,联用 NADH 氧化酶 ( ) ( ) NOX 和辣根过氧化物酶 HRP ,可检测低至 100 nmol/ L 的NADH 。 慈云祥等11 发现 ,在 HRP 的作用下 , H O 能够氧化 L 酪氨酸产生荧光二聚体。本实验发现 ,血 2 2 ( ) ( ) 红蛋白 Hb 具有和天然过氧化物酶 HRP