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ELISA方法的及步骤 2007-3-17 23:37:59　信息来源：来源网络　 　　ELISA方法的及步骤 生 物 谷 网 站ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。 　　(一)　原理 　　ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。 　　(二)　操作步骤 　　方法一　用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 　　1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。 　　2.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。 　　3.　加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37孵育0.5～1小时，洗涤。 　　4.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，3710～30分钟。 　　5.　终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 　　6.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 　　方法二　用于检测未知抗体的间接法： 　　　　　　用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml， 　　　　　　每孔加0.1ml，4过夜。次日洗涤3次。 　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔 　　　　　　中,置37孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照) 　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml， 　　　　　　37孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。 　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。 　　(三)　试剂器材 　　1.　试剂 　　(1)　包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液): 　　　　　　NaCO３　　　　1.59克 　　　　　　NaHCO３　 2.93克 　　　　　　加蒸馏水至1000ml 　　(2)　洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M 　　　　　　KH2PO4 　　　　　0.2克 　　　　　　Na2HPO４·12H2O　　2.9克 　　　　　　NaCl　　　　　　　8.0克 　　　　　　KCl　　　　　　　　0.2克 　　　　　　Tween-20　0.05％　0.5ml 　　　　　　加蒸馏水至1000ml 　　(3)　稀释液： 　　　　　　　牛血清白蛋白(BSA) 0.1克 　　　　　　　加洗涤缓冲液至100ml 　　　　或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。 　　(4)　终止液(2M　H２SO４）： 　　　　蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。 　　(5)　底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸): 　　　　0.2M Na２HPO４(28.4克／L) 25.7ml 　　　　0.1M 柠檬酸(19.2克／L)　　　　　 24.3ml 　　　　加蒸馏水50ml。 　　(6)　TMB(四甲基联苯胺)使用液: 　　　　TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml 　　　　底物缓冲液(PH5.5)　　　 10ml 　　　　0.75％H２O２　　 　32μl