PCR技术应用十二结核杆菌诊断.pdfVIP

中国试剂网 3.9.54 PCR 技术应用十二：结核杆菌诊断 结核杆菌可以导致全身性疾病，特别是在发展中国家，其发病率较高，危害性 极大.近几年结核杆菌的变异性较大，对抗痨药物的耐药性增加，从而使结核病 的发病大幅度增高.虽然传统的涂片抗酸染色、细菌培养以及胸片检查对大部分 结核能作出正确的诊断，但对某些病人亦可造成误诊或漏诊;动物接种虽特异性 较高，但因时间较长，不能满足临床快速诊断的需要.近几年也出现了几种快速 诊断方法，但也存在较大的缺陷，如短期培养后抗原免疫原性分析，即用放免方 法或酶联免疫吸附试验(ELISA)检测 BACTEC 培养瓶中被培养标本所分泌的抗 原，该方法可在 BACTEC 瓶本身鉴定出细菌之前，结合ELISA 和涂片抗酸染色 有效地鉴别典型和非典型分枝杆菌，敏感性较高，但存在培养时间长，重复性尚 差的缺点.另一种是短期培养后核酸探针杂交法，即用特异性 DNA 探针与 BACTEC 瓶中培养的细菌染色体 DNA 杂交.该方法能有效地防止培养的假阴性 结果，但却易发生假阳性结果，加之采用的方法较为复杂和繁琐，又有涉及同位 素操作之嫌等，因而近来已较少应用.上面两种方法都要借助细菌培养来进行， 虽然在时间上比传统培养大大缩短，但缺乏快速诊断的优势.近几年兴起的 PCR 方法基本实现了快速、灵敏、准确地诊断结核的目的，并且该方法正趋于常规化 地应用于临床一般实验室.应用 PCR 方法检测结核杆菌的首要条件是设计一对特 异性 DNA 引物.该引物所引导的 DNA 扩增序列应是结核杆菌独有的，且是结核 杆菌的保守序列，这样才能保证检测结果的特异性.PCR 方法的另外几个关键因 素是:①DNA 提取，即对有限的结核杆菌应尽量地将其DNA 完整、全部地提取; ②TaqDNA 聚合酶的活性;③PCR 产物的检测方法，即将PCR 产物进行快速、灵 敏、安全、准确的检测. 一、结核杆菌 DNA 的提取 在该技术上，目前仍无一种统一常规化的方法.现有各方法都存在着提取 DNA 不足的缺点，因此，敏感性受到影响.现在主要的细菌裂解方法是:①蛋白酶 K 加表面活性剂法;②蛋白变性剂加表面活性剂煮沸法;③反复冻融法;④超声波 法;⑤溶菌酶加表面活性剂法.提取DNA 的方法主要有:①酚一氯仿提取法:即用酚 一氯仿抽提含有裂解菌体的溶液，然后用乙醇从抽提后的溶液中沉淀DNA.有的 学者将硅酮加入酚一氯仿中，使水相和有机相的界面更牢固，这样不但能减少抑 中国试剂网 3.9.54 制因子混入水相 ，而且使 DNA 提取量比未加硅酮方法高 20% ～30%; ② Chaotrop-silica 法:用二氧化硅(sio2)吸附裂解菌体释放出的 DNA ，该二氧化硅用 70%乙醇洗涤，而后干燥，最后用双蒸水洗脱(55℃).有报道认为该方法可以消除 痰中的某些抑制因子.有的学者发现未预裂解的结核杆菌直接煮沸进行 PCR 的效 果与预先处理的相仿，提示结核杆菌不预裂解也可直接进PCR.但加入的菌数应 约 1000 个，否则细菌蛋白会对 PCR 产生抑制作用. 二、引物的设计 根据不同型结核杆菌的序列，目前常在下列几种序列内进行引物设计. (一)编码结核杆菌抗原的基因序列 1.编码 65-KDa 蛋白抗原的基因序列:结核杆菌 65-KDa 蛋白抗原为存在于所 有分枝杆菌细胞壁中的热休克蛋白，也是一种交叉反应蛋白.所以依据该序列设 计合成的引物，PCR 能扩增出所有分枝杆菌的靶 DNA 片段，没有属内特异性. 这种 PCR 较适用于结核病高发区大规模筛选和流行病普查.另外，对 65-K