测序级胰蛋白酶的制备工艺与质量检测.pdf

生 物 技 术 通 讯 76 LETTERSINBIOTECHNOLOGY Vol.25No.1 Jan.,2014 doi: 10.3969/j.issn.1009-0002.2014.01.019 研究报告 测序级胰蛋白酶的制备工艺与质量检测 1，2 1 2 喻峰 ，卢大儒 ，陈薇 1. 复旦大学 生命科学学院，上海 200433；2. 中国科学院 上海生命科学学院生化细胞研究所蛋白质组研究分析中 心，上海 200031 ［摘要］ 目的：制备高纯度、酶解效率高、酶切位点专一的测序级胰蛋白酶，应用于蛋白组学研究的蛋白质鉴定与分 析中。方法：取实验室自制的猪胰蛋白酶粗酶，经硼氢化钠、甲醛还原甲基化修饰抑制胰蛋白酶自水解，采用高效液 相色谱仪15RPC反相柱纯化，收集对应的甲基化胰蛋白酶峰组分，冷冻干燥；甲基化修饰的胰蛋白酶进一步经甲苯 磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）修饰，以抑制糜蛋白酶等非特异性酶切活性，并经反相色谱柱再纯化，获得终产物即质 谱测序级胰蛋白酶；自制的测序级胰蛋白酶经SDS、HPLC反相色谱分析、酶比活力测定，并应用于胶内蛋白质 酶切质谱鉴定氨基酸序列等，检测其纯度、酶水解效率及酶切位点特异性。结果：自制甲基化TPCK修饰的测序级胰 蛋白酶纯度大于95%，酶比活力为200 U/mgP（TAME）以上，质谱分析酶切特异性好；且酶的制备工艺流程稳定，可应 用于测序级胰蛋白酶产品的生产与开发中。结论：制备的测序级胰蛋白酶纯度高、酶解效率优、酶切特异性强，可广 泛应用于实验室中蛋白质和肽段测序鉴定、HPLC肽段谱图分析等蛋白组学研究分析中。 ［关键词］ 胰蛋白酶；还原甲基化；TPCK修饰；高效液相色谱；反相色谱纯化；质谱分析 ［中图分类号］ Q502 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1009-0002（2014）01-0076-06 Preparation and Characterization of Sequencing Grade Modified Trypsin 1,2 1 2 YU Feng *, LU Da-Ru, CHEN Wei 1. School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433; 2. Research Center for Proteome Analysis, Insti⁃ tute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Science, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031; China *Corresponding author, E-mail: fengyu_yu@ ［Abstract］Objective: To prepare highly purified, effective, restriction site-specific and chemically stabilized se⁃ quencing grade modified trypsin, and apply for protein identification and analysis in proteomics research. Meth⁃ ods: Firstly, raw trypsin isolated from porcine pancreas was reductive methylated with sodium borohydride buffer and formaldehyde following purification by reverse phase chromatography of 15RPC column, producing a stable tryp⁃ sin that